蛋氨酸合酶正向調(diào)控植物對多種RNA和DNA病毒的防御能力，為作物廣譜抗病育種提供新靶點(diǎn)

植物病毒是全球農(nóng)作物生產(chǎn)中的重大威脅，每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。開發(fā)廣譜抗性品種是控制病毒病害最有效的方法。本研究首次揭示了植物蛋氨酸合酶（Methionine Synthase， MS）作為宿主抗病毒防御的正向調(diào)控因子，通過干擾病毒編碼的基因沉默抑制子（VSR）的功能，在多種重要作物中賦予了對多種RNA和DNA病毒的廣譜抗性。

植物病毒種類繁多，危害嚴(yán)重，利用抗性品種是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的防治手段。然而，作物常受到多種病毒及其不同毒株的侵染，發(fā)掘具有廣譜抗性的基因至關(guān)重要。目前已知的廣譜抗病毒基因數(shù)量有限，主要集中在針對單一病毒的多個(gè)毒株或少數(shù)幾種病毒。宿主抗病毒RNA干擾是植物防御的核心機(jī)制，而病毒則通過編碼VSR來抑制這一通路。植物也進(jìn)化出多種方式反制VSR，例如通過固有免疫受體識別VSR觸發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)的免疫、通過泛素-蛋白酶體或自噬途徑降解VSR、對VSR進(jìn)行翻譯后修飾，或產(chǎn)生直接結(jié)合并失活VSR的特定抑制蛋白。這些VSR抑制劑具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值，是發(fā)掘廣譜抗病基因的寶庫。

大麥黃矮病毒是危害全球禾谷類作物的重要病原。其17K蛋白是一個(gè)多功能的VSR，同時(shí)具備運(yùn)動(dòng)蛋白和抑制宿主有絲分裂的功能。通過研究17K與宿主的相互作用，有助于發(fā)掘增強(qiáng)宿主抗性的基因和過程。

為了鑒定BYDV 17K的潛在互作蛋白，研究團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)基因^擬南芥株系中進(jìn)行免疫沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜分析，鑒定出5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1，即蛋氨酸合酶1。酵母雙雜交、分裂熒光素酶互補(bǔ)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了17K與AtMS1的互作。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，大麥的HvMS1和HvMS2、普通小麥的六個(gè)MS同源蛋白均能與17K互作。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在BYDV感染的大麥和小麥植株中，MS抗體能夠沉淀出17K蛋白，而模擬接種的對照組中則沒有，說明這種互作在病毒感染的植物體內(nèi)確實(shí)發(fā)生。

在BYDV感染過程中，大麥和小麥中MS基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白豐度在早期上調(diào)。利用大麥條紋花葉病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)降低大麥HvMS表達(dá)后，植株對BYDV表現(xiàn)出更高的感病性，病毒CP基因表達(dá)和17K蛋白積累水平顯著升高。在小麥中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制了TaMS1和TaMS2多個(gè)同源基因的敲除或功能破壞型突變體。與野生型對照相比，這些MS蛋白豐度降低的突變體在感染BYDV后，病毒17K的轉(zhuǎn)錄本和蛋白積累量更高，根系生長受到更嚴(yán)重的抑制，在灌漿期表現(xiàn)出更嚴(yán)重的黃矮病癥狀。其中，敲除表達(dá)量較高的TaMS1A或同時(shí)敲除TaMS1A和TaMS2A，會(huì)使植株對BYDV更為敏感。

研究構(gòu)建了過表達(dá)FLAG標(biāo)記的HvMS1蛋白的小麥轉(zhuǎn)基因株系。在正常生長條件下，這些過表達(dá)株系植株稍矮，但籽粒大小、單粒重和單株產(chǎn)量有所提高。在BYDV感染試驗(yàn)中，過表達(dá)株系表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性：植株高度和根長顯著優(yōu)于對照，病毒RNA積累顯著減少，BYDV 17K轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平大幅降低。此外，過表達(dá)株系對另一種小麥病毒——大麥條紋花葉病毒也表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，葉片病狀更輕，病毒CP基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平也更低。這些數(shù)據(jù)表明，過表達(dá)HvMS1能提升小麥對BYDV和BSMV的抗性。

為了驗(yàn)證MS蛋白是否對多種病毒具有廣譜抗性，研究在本氏煙中進(jìn)行驗(yàn)證。利用TRV介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制了針對四個(gè)NbMS基因成員的雙突變體（nbms ac和nbms ad）。這些突變體NbMS蛋白水平降低了28%-46%。當(dāng)感染馬鈴薯X病毒、煙草脆裂病毒或甜菜嚴(yán)重曲頂病毒時(shí)，與對照相比，突變體表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病癥、更強(qiáng)的病毒基因積累和更快的病程發(fā)展。反之，過表達(dá)HA標(biāo)記的HvMS1的本氏煙轉(zhuǎn)基因株系，則對PVX、TRV和BSCTV的感染表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性：癥狀更輕，病毒積累量更低。這些結(jié)果表明，NbMS基因是宿主防御多種植物RNA和DNA病毒的正向調(diào)控因子。

為了探究MS蛋白正向調(diào)控抗病毒防御的機(jī)制，研究檢測了HvMS1是否能結(jié)合不同病毒的VSR并抑制其功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HvMS1能與BSMV的γb、PVX的25K、TRV的16K、BSCTV的C2以及TBSV的P19等VSR蛋白互作。更重要的是，在16c煙草（一個(gè)具有組成型基因沉默活性的系統(tǒng)）中進(jìn)行的抗沉默功能實(shí)驗(yàn)表明，雖然這些VSR本身能夠恢復(fù)GFP的表達(dá)（證明其具有抑制基因沉默的活性），但共表達(dá)HvMS1會(huì)顯著削弱這種能力，表現(xiàn)為GFP熒光、轉(zhuǎn)錄本和蛋白積累水平的下降。而對照GUS蛋白的表達(dá)則沒有這種抑制效果。此外，研究還發(fā)現(xiàn)HvMS1能與另外四種病毒的VSR互作，并同樣抑制其抗沉默功能。這些數(shù)據(jù)表明，植物MS蛋白能夠廣泛地與多種RNA和DNA病毒的VSR相互作用，并抑制其抗基因沉默功能。

本研究首次提供了植物MS蛋白正向調(diào)控抗病毒防御的直接遺傳和分子證據(jù)。研究數(shù)據(jù)表明，MS蛋白通過結(jié)合并抑制多種病毒VSR的抗沉默功能，從而在單子葉和雙子葉植物中增強(qiáng)對RNA和DNA病毒的廣譜抗性。這與病毒侵染后MS基因表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象一致，推測這是宿主增強(qiáng)防御的一種反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)的MS蛋白，與先前報(bào)道的rgs-CaM、ZmVDE和ZmTGL等VSR抑制劑類似，代表了一類新的、通過直接互作抑制VSR功能的宿主抗病毒蛋白。初步分析表明，HvMS1與VSR的互作可能涉及蛋白界面靜電互補(bǔ)性，這有助于解釋其為何能與序列同源性低的多種VSR結(jié)合。此外，有研究提示蛋氨酸循環(huán)相關(guān)代謝物如S-腺苷甲硫氨酸的增加可能通過穩(wěn)定病毒來源的小干擾RNA或影響乙烯合成來增強(qiáng)抗性，這為MS蛋白的抗病毒機(jī)制提供了更多探索方向。

鑒于氣候變化加劇了植物病毒病的發(fā)生，培育具有廣譜抗性的作物品種至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，植物MS蛋白是一個(gè)可用于設(shè)計(jì)作物廣譜抗病毒性的有價(jià)值靶標(biāo)。值得注意的是，過表達(dá)HvMS1的小麥品系還表現(xiàn)出改良的農(nóng)藝性狀，這預(yù)示著MS蛋白的工程化改造可能帶來抗病與增產(chǎn)的雙重效益。未來，利用人工智能輔助的蛋白質(zhì)/mRNA修飾和創(chuàng)新的基因組編輯技術(shù)，對植物MS蛋白進(jìn)行研究和改造，有望推動(dòng)開發(fā)出對包括RNA和DNA病毒在內(nèi)的多種病原體具有優(yōu)異廣譜抗性的作物品種。

本研究使用了多種植物材料，包括大麥品種Golden Promise、^擬南芥Col-0、小麥品種Fielder和本氏煙。病毒接種、基因克隆、載體構(gòu)建、抗體制備等均按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。蛋白質(zhì)互作鑒定采用了免疫沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜、酵母雙雜交、分裂熒光素酶互補(bǔ)、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀等多種技術(shù)。基因功能研究手段包括病毒誘導(dǎo)的基因沉默、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)。病毒積累和基因表達(dá)分析采用了RNA印跡、DNA印跡、RT-qPCR和蛋白免疫印跡等方法。生物信息學(xué)分析用于鑒定不同物種中的MS同源基因，并利用AlphaFold 3進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模和靜電勢分析。