《Plant Biotechnology Journal》：Natural Variations in the Activity of Hydroxycinnamoyl Transferases Promote Accumulation of Metabolites Conferring Rice Resistance
編輯推薦：
這項研究通過解析水稻羥基肉桂酰轉移酶OsSHT1與OsSHT2的功能，揭示了它們通過調控苯丙烷代謝途徑，影響抗菌中間代謝物（如p-香豆酸、阿魏酸）和最終代謝物（如木質素、黃酮）的積累，從而決定水稻對細菌性病原菌（Xoo、Xoc）抗性的新機制。研究發現轉錄因子OsMYB30能直接抑制OsSHT1/2的表達，其天然變異體OsMYB30D239因蛋白穩定性更強而抑制能力更佳。通過鑒定OsSHT1/2及OsMYB30的優勢單倍型（Hap1/D239），該研究為水稻抗病育種提供了寶貴的遺傳資源和分子模塊（OsMYB30-OsSHTs）。
1 引言
植物在應對病原菌攻擊時會啟動復雜的防御策略，其中苯丙烷代謝途徑產生的次生代謝物扮演著關鍵角色。木質素和黃酮類化合物是兩類重要的最終代謝物，而p-香豆酸和阿魏酸等中間代謝物則被報道對侵染人類和動物的病原菌具有毒性作用，但其在植物病原菌中的作用尚不清楚。先前的研究預測水稻中的OsSHT1和OsSHT2編碼羥基肉桂酰轉移酶，但其具體的酶學功能及其在植物免疫中的作用機制仍是未知領域。
2.1 病原菌侵染誘導OsSHT1和OsSHT2表達
研究表明，OsSHT1和OsSHT2在水稻不同組織中均有表達，其中在葉鞘和莖中表達相對最高，根部最低。當水稻葉片受到白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae, Xoo）和細菌性條斑病菌（X. oryzaepv. oryzicola, Xoc）侵染時，這兩個基因的表達均被顯著誘導，暗示它們可能參與水稻的免疫反應。
2.2 OsSHT1和OsSHT2負調控水稻對細菌性病原菌的抗性
為探究OsSHT1和OsSHT2在抗病中的作用，研究團隊利用CRISPR/Cas9技術在ZH11背景中創建了ossht1和ossht2的單突變體及雙突變體。接種實驗表明，與野生型相比，ossht1和ossht2單突變體對多種Xoo和Xoc菌株均表現出更強的抗性，病斑長度更短，葉片內病原菌數量顯著降低。雙突變體ossht1/2的抗性進一步增強。此外，突變體中病程相關基因（OsPR1, OsPR10）和抗病反應基因（OsWRKY45）的表達也顯著上調。這些結果共同表明OsSHT1和OsSHT2以功能疊加的方式負調控水稻對細菌病原菌的抗性。
2.3 OsSHT1和OsSHT2是具有功能的羥基肉桂酰轉移酶
亞細胞定位實驗證實OsSHT1和OsSHT2定位于細胞質。蛋白序列比對和系統發育分析顯示它們與其他植物的SHT蛋白高度同源，具有保守的HXXXD和DXGWX結構域。體外酶活分析顯示，重組OsSHT1和OsSHT2蛋白能利用p-香豆酰輔酶A（p-Coumaroyl-CoA）和阿魏酰輔酶A（feruloyl-CoA）作為酰基供體，并以亞精胺（spermidine）為最偏好受體，其次為精胺（spermine）和腐胺（putrescine）。酶動力學參數表明OsSHT2的催化效率高于OsSHT1。
2.4 敲除OsSHT1和OsSHT2改變代謝物積累
體內驗證發現，ossht1和ossht2突變體葉片中，以亞精胺為受體的羥基肉桂酰轉移酶活性顯著降低，其直接催化產物香豆酰亞精胺（coumaroyl spermidine）和阿魏酰亞精胺（feruloyl spermidine）的含量也相應減少。與此同時，作為催化底物的p-香豆酸（p-Coumaric acid）和阿魏酸（ferulic acid）則顯著積累。雙突變體中的這些變化更為顯著。
2.5 p-香豆酸和阿魏酸抑制細菌病原菌的生長
鑒于突變體中積累的p-香豆酸和阿魏酸具有已知的抗菌潛力，研究測試了這兩種化合物對Xoo和Xoc毒力因子的影響。實驗表明，p-香豆酸和阿魏酸能劑量依賴性地抑制這兩種病原菌的鞭毛運動性和胞外多糖（EPS）的產生。它們的半抑制濃度（IC50）在1.22至1.87 mM之間。在接種病原菌前向菌液中添加這兩種化合物，能顯著減輕水稻的發病程度，證實了它們直接的抗菌作用。
2.6 敲除OsSHT1和OsSHT2改變木質素和黃酮的積累
p-香豆酰輔酶A和阿魏酰輔酶A也是苯丙烷途徑中合成木質素和黃酮類物質的關鍵前體。研究發現，ossht1和ossht2突變體中，多個木質素合成相關基因（如OsCCR20, OsCAD2）和黃酮合成相關基因（如OsCHS1, OsCHI）的表達顯著上調。組織化學染色和定量分析證實，突變體葉片維管束中木質素沉積增加，總木質素和黃酮含量也顯著高于野生型。這表明敲除OsSHT1/2阻斷了向香豆酰亞精胺和阿魏酰亞精胺的分支代謝，使得代謝流更多地導向木質素和黃酮的合成。
2.7 敲除OsSHT1和OsSHT2不影響水楊酸積累和農藝性狀
苯丙烷途徑也參與水楊酸（SA）的生物合成。然而，測量發現ossht1和ossht2突變體中的SA水平與野生型無異，說明該基因的缺失并不影響SA途徑。此外，突變體在株高、旗葉長、穗數、粒型、千粒重等一系列重要農藝性狀上與野生型沒有顯著差異，表明敲除這兩個基因在增強抗性的同時不會對水稻生長和產量造成不利影響。
2.8 OsSHT1和OsSHT2的自然變異
通過對RiceVarMap數據庫中超過4500份水稻種質的序列分析，在OsSHT1和OsSHT2的啟動子區分別鑒定出11和12個單核苷酸多態性（SNPs），并據此劃分為兩種單倍型（Hap1和Hap2）。其中，OsSHT1Hap1和OsSHT2Hap1主要分布在熱帶粳稻和溫帶粳稻中，而OsSHT1Hap2和OsSHT2Hap2則主要分布在秈稻、中間型和Aus稻中。對100份微型核心種質的抗性評價顯示，攜帶Hap1單倍型的材料病斑更短，且OsSHT1/2的表達水平顯著低于攜帶Hap2的材料，這與基因的負調控抗性功能一致。對野生稻（Oryza rufipogon）和雜交稻的分析發現，優勢單倍型組合（OsSHT1Hap1+ OsSHT2Hap1）在野生稻中廣泛分布，但在現代雜交稻育種中尚未被廣泛聚合利用。
2.9 OsSHT1或OsSHT2的變異改變苯丙烷代謝
對不同單倍型組合水稻材料的代謝分析進一步證實了這一機制。攜帶OsSHT1Hap1和OsSHT2Hap1的材料，其羥基肉桂酰轉移酶活性最低，香豆酰亞精胺和阿魏酰亞精胺含量最少，而p-香豆酸、阿魏酸、木質素和黃酮的含量則最高。相反，攜帶OsSHT1Hap2和OsSHT2Hap2的材料則呈現相反的趨勢。這證明OsSHT1/2的自然變異通過影響其表達水平，進而精準調控苯丙烷代謝物的流向和積累，最終決定抗病表型。
2.10 OsMYB30抑制OsSHTs的轉錄
為尋找上游調控因子，研究通過酵母單雜交篩選發現轉錄因子OsMYB30能結合到OsSHT1和OsSHT2的啟動子上。序列分析發現這兩個啟動子均含有OsMYB30的結合基序MC1。實驗證實，在OsMYB30過表達（OsMYB30ox）株系中，OsSHT1/2的表達被抑制；而在OsMYB30敲除（OsMYB30KO）株系中，其表達則上升。電泳遷移率變動分析（EMSA）、染色質免疫共沉淀（ChIP-qPCR）以及水稻原生質體瞬時表達實驗均證實，OsMYB30能直接結合到OsSHT1/2啟動子的MC1序列上，并抑制其轉錄活性。
2.11 OsMYB30在遺傳上作用于OsSHTs上游
遺傳學實驗進一步驗證了OsMYB30與OsSHTs的上下級關系。osmyb30單突變體對Xoo表現為感病性增強，而osmyb30 ossht1/2三突變體則恢復了與ossht1/2雙突變體相似的抗性表型，表明OsSHTs位于OsMYB30的下游執行功能。代謝物測量顯示，OsMYB30ox植株中香豆酰亞精胺和阿魏酰亞精胺含量降低，而p-香豆酸、阿魏酸、木質素和黃酮含量升高；OsMYB30KO植株則呈現相反變化。這證明了OsMYB30通過抑制OsSHTs的表達來調控苯丙烷代謝流向。
2.12 OsMYB30和OsSHTs的自然變異共同決定抗性
對超過4000份水稻種質的分析發現，OsMYB30編碼區存在一個SNP（838G/A），導致第239位氨基酸由天冬氨酸（D）變為谷氨酸（E），形成了OsMYB30D239和OsMYB30E239兩種單倍型。攜帶OsMYB30D239的材料對Xoo的抗性更強。雖然兩種蛋白的亞細胞定位和與DNA的結合親和力無差異，但細胞游離降解實驗和雙熒光素酶報告實驗表明，OsMYB30D239蛋白比OsMYB30E239更穩定，因此對OsSHT1/2轉錄的抑制能力更強。在自然種質中，OsMYB30D239單倍型也與更低的OsSHT1/2表達水平和更強的抗性相關。
3 討論
本研究系統闡明了OsSHT1和OsSHT2作為羥基肉桂酰轉移酶，催化苯丙烷代謝的一個分支（生成香豆酰亞精胺和阿魏酰亞精胺），從而與合成木質素和黃酮的主流途徑形成競爭。當這兩個基因的功能缺失或表達被抑制時，代謝流轉向，導致具有直接抗菌活性的中間代謝物（p-香豆酸、阿魏酸）和增強物理/化學屏障的最終代謝物（木質素、黃酮）同時積累，協同賦予水稻對Xoo和Xoc的抗性。轉錄因子OsMYB30作為該通路的關鍵上游負調控因子，直接抑制OsSHT1/2的表達，從而正向調控抗性。研究發現的天然優勢單倍型OsMYB30D239、OsSHT1Hap1和OsSHT2Hap1為通過分子標記輔助選擇聚合多個優異等位基因，培育廣譜、持久抗病的水稻新品種提供了重要的遺傳資源和理論依據。
