《Advanced Science》：Activated Platelet–Released Heat Shock Protein 90α Triggers Autophagy-Dependent Neutrophil Extracellular Trap Formation and Amplifies Sepsis
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本研究揭示了血小板在膿毒癥血栓炎癥中的關(guān)鍵新機制。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血小板中熱休克蛋白90α（HSP90α）顯著上調(diào)。當血小板活化時，HSP90α會轉(zhuǎn)運并釋放到胞外空間。胞外的HSP90α作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP），通過與中性粒細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活下游MyD88-Beclin 1信號通路，誘導自噬，最終驅(qū)動中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）形成，加劇凝血異常和炎癥。阻斷胞外HSP90α可有效抑制NET形成，減輕血栓和器官損傷。該“血小板-HSP90α-TLR4-自噬-NET”軸為理解膿毒癥免疫血栓形成提供了新見解，并提示靶向eHSP90α是潛在的治療新策略。
膿毒癥是一種危及生命的疾病，其器官功能障礙源于宿主對感染反應的失調(diào)，凝血病是導致多器官衰竭和死亡率增加的關(guān)鍵因素。血小板在膿毒癥血栓和凝血異常的發(fā)生中至關(guān)重要，但其促發(fā)病理過程的機制尚未完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，血小板釋放的熱休克蛋白90α是驅(qū)動中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成和支持膿毒癥期間血栓炎癥的關(guān)鍵角色。
血小板中HSP90α表達上調(diào)源于巨核細胞TLR4信號
對膿毒癥患者血小板進行蛋白質(zhì)組學分析顯示，HSP90α顯著增加。通過轉(zhuǎn)錄組分析和體內(nèi)外實驗驗證，研究者將這一上調(diào)追溯至起源于巨核細胞的運輸途徑。巨核細胞在膿毒癥期間通過Toll樣受體4信號感知炎癥，導致HSP90α mRNA表達增加，并隨后將其傳遞給血小板。在TLR4-/-膿毒癥小鼠的巨核細胞和血小板中，Hsp90aa1表達顯著降低，證實了TLR4信號對于膿毒癥期間巨核細胞HSP90α上調(diào)至關(guān)重要。
血小板活化觸發(fā)HSP90α膜轉(zhuǎn)位和釋放
在靜息血小板中，HSP90α彌散分布在胞質(zhì)內(nèi)。當被凝血酶激活后，HSP90α重新定位于質(zhì)膜，形成特征性的環(huán)狀模式，這一過程依賴于肌動蛋白聚合。流式細胞術(shù)和免疫印跡分析進一步證實，血小板活化后，HSP90α在質(zhì)膜表達增加，在細胞內(nèi)減少，并且HSP90α存在于血小板釋放物的胞外部分。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測到凝血酶刺激的血小板上清液中存在HSP90α。研究表明，HSP90α在被血小板釋放時，既以游離形式存在，也與外泌體相關(guān)。此外，與健康供體相比，膿毒癥患者來源的血小板釋放的HSP90α水平顯著增加，并且膿毒癥患者的血小板貧乏血漿（富含凝血酶）也能刺激血小板將HSP90α動員至膜表面。
血小板釋放的HSP90α通過中性粒細胞加劇膿毒癥誘導的血栓形成
在膿毒癥小鼠模型中，血漿HSP90α水平顯著升高，而使用抗血小板抗體耗竭血小板可使血漿HSP90α水平降低約49%，表明血小板是膿毒癥期間循環(huán)eHSP90α的主要來源。使用靶向HSP90α的特異性中和抗體1G6-D7處理膿毒癥小鼠，可顯著降低凝血酶-抗凝血酶復合物水平，恢復纖維蛋白原水平，并明顯減少肝臟和肺組織中的血栓形成和血小板聚集。同時，促炎細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的系統(tǒng)性水平也顯著降低。為探究eHSP90α促血栓作用的機制，研究者通過分析公開的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)，將中性粒細胞鎖定為eHSP90α介導的血栓炎癥反應的潛在效應細胞。在膿毒癥小鼠中使用抗Ly6G抗體選擇性耗竭中性粒細胞，可顯著減輕HSP90α相關(guān)的凝血異常和血栓形成，并抑制系統(tǒng)性炎癥。這些結(jié)果表明，中性粒細胞是膿毒癥期間eHSP90α觸發(fā)血栓炎癥反應的關(guān)鍵貢獻者。
eHSP90α通過激活中性粒細胞自噬觸發(fā)胞外誘捕網(wǎng)形成
研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血漿中NET形成顯著增加，且血漿HSP90α水平與NET形成呈正相關(guān)。在體外，用膿毒癥患者PPP或血小板與中性粒細胞共培養(yǎng)可誘導NET形成，而用中和抗體1G6-D7阻斷eHSP90α則可顯著抑制此過程。直接用重組HSP90α刺激中性粒細胞能以劑量依賴性方式增強NET形成。在體內(nèi)，1G6-D7治療也能顯著抑制膿毒癥模型中的NET形成。已知NET形成需要自噬參與。單細胞RNA測序分析顯示，膿毒癥患者中性粒細胞中自噬相關(guān)基因表達和自噬評分更高。透射電鏡觀察到，重組HSP90α刺激后中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)自噬體和自溶體積累增加。免疫印跡和共聚焦顯微鏡證實，重組HSP90α可上調(diào)LC3B-II、下調(diào)p62，誘導自噬體形成，而HSP90α抗體及自噬抑制劑3-MA和Bafilomycin A1可部分逆轉(zhuǎn)此效應。同時，HSP90α誘導的NET形成也能被這些抑制劑顯著抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，胞外HSP90α通過誘導中性粒細胞自噬來觸發(fā)NET形成。
eHSP90α通過TLR4誘導中性粒細胞自噬
為探索eHSP90α誘導自噬的機制，研究者考察了TLR4的參與。共免疫沉淀實驗和免疫熒光分析證實了eHSP90α與TLR4胞外域的直接相互作用。用TLR4及其下游銜接蛋白MyD88的藥理抑制劑處理中性粒細胞，可顯著抑制HSP90α誘導的自噬流。蛋白質(zhì)G/A瓊脂糖珠共免疫沉淀實驗顯示，在HSP90α刺激的中性粒細胞中，MyD88和Beclin 1之間的相互作用增強，同時Beclin 1與Bcl-2復合物被破壞。重要的是，HSP90α刺激導致中性粒細胞中磷酸化Beclin 1水平顯著增加，而HSP90α中和抗體及TLR4和MyD88抑制劑可減弱此效應。抑制TLR4或MyD88也能顯著減少NET形成。使用TLR4-/-小鼠進一步驗證了TLR4的作用：與野生型小鼠相比，TLR4-/-小鼠的中性粒細胞對HSP90α誘導的自噬和NET形成反應減弱，對膿毒癥來源血小板誘導的NET形成也受損。這些發(fā)現(xiàn)證明，eHSP90α通過TLR4/MyD88/Beclin 1依賴性信號通路驅(qū)動中性粒細胞自噬及隨后的NET形成。
討論與意義
本研究闡明了膿毒癥中血小板與NET相互作用的一條新通路。HSP90α在膿毒癥血小板中顯著上調(diào)，并源自巨核細胞。血小板活化后釋放的HSP90α，通過TLR4/MyD88/Beclin 1信號通路誘導自噬驅(qū)動的NET形成。使用HSP90α中和抗體1G6-D7可有效抑制該通路，減少NET形成，從而減輕膿毒癥相關(guān)血栓和炎癥。這加深了我們對血小板誘導免疫血栓形成的理解。目前大多數(shù)抗血栓療法通過靶向血小板活化相關(guān)的膜受體或細胞內(nèi)信號通路發(fā)揮作用，但在膿毒癥患者中可能增加出血風險。本研究提示，靶向致病性血小板衍生因子（如eHSP90α）而非血小板活化本身，可能提供一種更安全有效的治療策略。然而，研究也存在一定局限性，如臨床樣本均來自兒童，向成人膿毒癥的推演需謹慎；HSP90α廣泛表達，其中和抗體的潛在脫靶效應和長期安全性需嚴格的臨床前評估。總之，該研究強調(diào)了血小板源性eHSP90α在驅(qū)動自噬依賴性NET形成中的關(guān)鍵作用，并提出靶向eHSP90α可能是治療膿毒癥血栓的一種有潛力的新方法。
