Hrd3是從酵母到高等真核生物中保守的ERAD組分。通過同源比對，研究人員在稻瘟病菌中鑒定出其同源蛋白MoHrd3（基因座MGG_13508）。為探究其功能，研究者利用同源重組策略構建了三個MoHrd3敲除突變體（ΔMohrd3）。表型分析發現，ΔMohrd3突變體在燕麥番茄瓊脂（OTA）培養基上的菌落生長顯著受限。此外，突變體的產孢能力也嚴重下降。重要的是，無論是噴霧接種還是傷口接種實驗，ΔMohrd3突變體在水稻葉片上形成的病斑數量和大小都顯著小于野生型P131菌株和回補菌株（cMoHrd3），這直接證明了MoHrd3對于稻瘟病菌的致病性是必需的。

為了解MoHrd3如何影響致病性，研究者進一步觀察了附著胞的形成過程。在疏水性蓋玻片上，野生型P131的分生孢子接種6小時后超過80%形成了黑色化的成熟附著胞，而ΔMohrd3突變體的附著胞成熟率低于40%。深入分析發現，突變體中負責提供膨壓的糖原和脂質的利用率下降，參與附著胞穿透所必需的septin環結構形成異常，并且附著胞的坍塌率顯著升高，表明其膨壓不足。在水稻鞘細胞侵染實驗中，接種36小時后，約70%的P131或cMoHrd3侵染點形成了具有一個或多個分支的侵染菌絲，而超過80%的ΔMohrd3突變體僅停留在附著胞階段。這些結果說明，MoHrd3在侵染早期的附著胞成熟、穿透以及后期的侵染菌絲擴展中都扮演著關鍵角色。

亞細胞定位顯示，MoHrd3-GFP與內質網標記蛋白mCherry-HDEL在菌絲、分生孢子和附著胞中廣泛共定位，證實其為內質網定位蛋白。分裂泛素酵母雙雜交實驗進一步證明MoHrd3與已知的ERAD組分MoHrd1和MoDer1直接相互作用，提示它們可能形成ERAD相關復合物。由于ERAD功能缺陷會引發內質網應激，導致未折疊蛋白反應（UPR）基因上調。實驗發現，在ΔMohrd3突變體中，多個UPR標志基因（如MoKAR2、MoPDI等）的表達均被顯著誘導。同時，突變體對可誘導ER應激的藥物衣霉素（TM）更為敏感。此外，ΔMohrd3突變體的整體蛋白質泛素化水平顯著降低。這些證據共同表明，MoHrd3在稻瘟病菌中是一個保守的ERAD組分，參與底物識別。

為了探索MoHrd3調控的通路，研究者對MoHrd3-GFP純化蛋白進行了LC-MS/MS分析，發現多個與自噬密切相關的分選和液泡膜組分蛋白。透射電鏡觀察顯示，在氮饑餓（MM-N）誘導下，野生型P131菌絲細胞的液泡內積累了多個自噬體，而ΔMohrd3突變體中自噬體數量顯著減少。利用自噬標志蛋白GFP-MoAtg8進行觀察發現，在基本培養基（CM）中，ΔMohrd3突變體細胞質中積累了更多、熒光更強的GFP-MoAtg8斑點；在氮饑餓誘導后，P131中大部分GFP信號進入液泡，而ΔMohrd3中仍有部分信號滯留在細胞質，表明自噬體與液泡的融合可能受阻。通過分析GFP-MoAtg8的降解和內源性MoAtg8的脂化形式MoAtg8-PE的降解，進一步證實ΔMohrd3突變體的自噬通量降低。這些結果支持MoHrd3這一保守的ERAD組分在自噬調控中發揮著重要作用。

酵母雙雜交實驗表明，MoHrd3特異性與自噬關鍵蛋白MoAtg8相互作用，但不與MoAtg1作用。這一相互作用在體內通過免疫共沉淀（Co-IP）和雙分子熒光互補（BiFC）實驗得到進一步驗證。BiFC實驗顯示，MoHrd3與MoAtg8在自噬體上互作，且使用液泡ATP酶抑制劑Concanamycin A（ConA）處理（誘導自噬體積累）后，互作信號增強。共定位分析顯示，在ConA處理或饑餓條件下，MoHrd3-GFP與mCherry-MoAtg8在自噬體或液泡中共定位。此外，研究發現MoHrd3本身可通過自噬途徑被降解，因為自噬抑制劑3-MA能增加MoHrd3的蛋白積累，而蛋白酶體抑制劑MG132則無此效應。

對IP-MS數據的重新分析發現，液泡膜蛋白MoYpt7（參與自噬）是MoHrd3的潛在互作蛋白。酵母雙雜交、Co-IP和BiFC實驗均證實了MoHrd3與MoYpt7的直接相互作用。有趣的是，與酵母系統不同，在稻瘟病菌中，MoAtg8也能通過Co-IP檢測到與MoYpt7的相互作用。關鍵發現是，MoHrd3的存在顯著增強了MoAtg8與MoYpt7之間的結合。相反，在ΔMohrd3突變體中，MoAtg8與MoYpt7的相互作用明顯減弱，而這種減弱可通過在Co-IP體系中添加重組的MoHrd3蛋白來挽救。基于AI的模型預測顯示，MoHrd3通過其C端區域招募MoAtg8，并通過其N端大結構域結合MoYpt7，暗示三者可能形成三元復合物。在ΔMohrd3突變體中過表達MoAtg8或MoYpt7，可以部分恢復其致病性缺陷，這從遺傳學角度證實了MoHrd3通過促進MoAtg8與MoYpt7的互作來調控自噬，進而影響致病性。

為了模擬侵染過程引發的內質網應激條件，研究者使用了DTT（一種ER應激誘導劑）進行處理。DTT處理后，P131和ΔMohrd1突變體中的GFP-MoAtg8大多轉移至液泡，而ΔMohrd3突變體中的信號仍滯留在細胞質中。當同時使用DTT和自噬體-液泡融合抑制劑Bafilomycin A1（Baf）處理時，P131和ΔMohrd1中的GFP-MoAtg8也被阻滯在細胞質，表型與ΔMohrd3相似。自噬通量分析也顯示，DTT誘導的自噬在ΔMohrd3中大幅減弱。重要的是，DTT處理增強了MoAtg8與MoHrd3的相互作用。致病性實驗發現，Baf處理能抑制野生型P131和ΔMohrd1的致病性，但對ΔMohrd3突變體的致病性沒有進一步影響，這表明MoHrd3介導的自噬體與液泡融合過程對稻瘟病菌的致病性至關重要。

MoHrd3直接結合MoAtg8并可被自噬降解，這符合選擇性自噬受體的特征。然而，對預測的多個ATG8相互作用基序（AIM）進行點突變后，MoHrd3與MoAtg8的相互作用依然存在，表明這種結合是AIM非依賴性的。進一步實驗發現，MoAtg8無法與C端缺失的MoHrd3結合，說明MoHrd3通過其C端與MoAtg8結合，因此它不是典型的選擇性自噬受體。由于在ERAD通路中，Hrd3作為銜接蛋白識別底物以進行蛋白酶體降解，研究者推測MoHrd3可能也作為銜接蛋白介導其靶蛋白的自噬性降解。他們選擇了一個對于附著胞形成和致病性至關重要的非典型G蛋白偶聯受體MoPth11進行研究。酵母雙雜交和Co-IP實驗證實，MoPth11與MoHrd3以及MoHrd1均存在相互作用。在饑餓條件下，ΔMohrd3突變體中MoPth11的泛素化水平顯著降低。蛋白質穩定性實驗表明，MoPth11的降解被自噬抑制劑3-MA抑制，而不受蛋白酶體抑制劑MG132影響，且MoPth11-GFP在饑餓條件下定位于液泡。這些結果說明MoPth11可通過自噬途徑降解。在ΔMohrd3突變體中，MoPth11的自噬性降解被廢除，其蛋白持續積累。類似地，MoHrd1的缺失也影響了饑餓誘導的MoPth11泛素化和積累。綜合來看，MoPth11在經歷由MoHrd1-MoHrd3復合物介導的泛素化后，通過MoHrd3作為銜接蛋白引導，被自噬途徑降解。致病性分析發現，無論是在P131背景還是ΔMohrd3、ΔMohrd1突變體背景中過表達MoPth11，都會導致致病性下降，這與MoPth11敲除突變體的表型類似，表明維持適當的MoPth11蛋白水平對稻瘟病菌的致病性至關重要。

內質網相關降解（ERAD）和自噬是維持內質網穩態的兩個主要策略。本研究首次在稻瘟病菌中發現，ERAD組分MoHrd3通過促進自噬體與液泡的融合來調控自噬水平。具體機制是，MoHrd3同時與MoAtg8和MoYpt7相互作用，并作為銜接蛋白增強兩者之間的結合，從而促進侵染誘導的自噬進程。此外，MoHrd3還作為一個銜接蛋白，在MoHrd1-MoHrd3復合物介導MoPth11泛素化后，引導其通過自噬途徑降解，以此調控致病性。MoHrd3本身也能通過自噬途徑被降解。ΔMohrd3突變體中，自噬體-液泡融合嚴重受損導致自噬減少，同時MoPth11等靶蛋白積累，共同導致致病性下降。這項研究建立了ERAD與自噬通路之間的直接分子聯系，揭示了ERAD組分在自噬中的直接作用，并為理解稻瘟病菌的毒力調控機制提供了新見解。