產時母體發熱是分娩過程中的常見癥狀，其主要由兩大因素引起。其一是廣泛用于分娩鎮痛的硬膜外鎮痛可能導致的一種不良反應，即硬膜外相關母體發熱（ERMF），這是一種非感染性炎癥過程，影響約20%至30%接受硬膜外麻醉的女性。另一種更為嚴重的發熱形式是絨毛膜羊膜炎相關發熱（CAM），由細菌侵入羊膜腔引起的感染所致。CAM顯著增加了新生兒早發型敗血癥、腦膜炎、長期神經系統后遺癥以及母親患子宮內膜炎和產后出血的風險。由于ERMF和CAM初期臨床表現相似，準確、快速的診斷對于及時、適當的治療至關重要。然而，目前的診斷主要依賴于連續的母親白細胞計數和C反應蛋白水平，其敏感性和特異性均不足。因此，迫切需要開發新的診斷工具，以實現產時發熱風險的準確預測和感染源的可信區分，從而促進精準臨床干預并改善圍產期結局。

先進的生物檢測納米材料因其易于制造和靈活適應性，正成為有前景的臨床診斷平臺。其中，糖組學比肽組學更緊密地與疾病進程相關，并且與下游代謝組學相比，糖組學的變化通常發生在疾病進展的更早期，為早期疾病檢測提供了更大潛力。然而，盡管糖組學在疾病發展中具有重要意義，但由于其廣泛的結構異質性、低豐度和復雜的預處理過程，很少被納入大規模的臨床診斷。因此，精心設計的先進納米材料對于克服這些限制，并彌合疾病特異性糖鏈與其高通量診斷應用之間的差距至關重要。石墨化碳納米材料因其與糖鏈之間的疏水效應、電子誘導偶極相互作用和電子重分配相互作用的能力，是用于未衍生化糖鏈研究最常用的材料。然而，傳統的石墨化碳材料通常結構簡單，需要與色譜聯用，延長了分析時間并阻礙了其臨床規模應用。因此，設計和構建一種集成了多尺寸孔結構和互連擴展通道的先進石墨化碳納米結構，有望充分利用三維互穿孔結構來增強糖鏈保留并提高傳質效率，從而滿足大規模、高通量臨床疾病診斷的需求。

本研究通過整合硬模板、溶劑控制成核和高溫煅燒的策略，設計并構建了層級多通道石墨化碳（HPGC-Z67）。該合成過程主要包括三個步驟：硬模板（單分散聚苯乙烯微球，PS）的制備、層級多孔MOF（HP-Z67）的構建以及高溫石墨化。表征結果顯示，HPGC-Z67保持了HP-Z67的晶體形態和大孔結構，這些大孔相互連接形成通道，促進了N-糖在HPGC-Z67結構內部的擴散和結合。

X射線衍射圖譜分析證實了HPGC-Z67的成功石墨化，并在26.5°和42.3°處檢測到對應于石墨化碳（PDF#41-1487）的（002）和（100）晶面的兩個明顯衍射峰。拉曼光譜中1350 cm^?1處的D峰和1589 cm^?1處的G峰進一步驗證了石墨化碳的存在。值得注意的是，HPGC-Z67的I_D/I_G比為0.91，低于GC-Z67的0.96，表明HPGC-Z67具有更高的石墨化程度，更有利于N-糖的保留。氮氣吸附/脫附等溫線和孔徑分布測試顯示，HPGC-Z67保持了其前體MOF的介孔結構，并表現出IV型等溫線特征，其孔徑（4.0 nm）大于GC-Z67（3.7 nm）。這種層級多孔結構有利于N-糖在互連的多孔通道中擴散，同時阻擋大的蛋白質干擾物，增強N-糖識別的特異性。此外，HPGC-Z67的BET比表面積為371.4 m²g^?1，總孔體積為0.28 cm³g^?1，均超過了GC-Z67（分別為320.1 m²g^?1和0.24 cm³g^?1）。更大的比表面積和孔體積為N-糖的保留提供了充足的位點。

使用卵清蛋白消化物作為糖標準品，對HPGC-Z67平臺的N-糖檢測性能進行了初步評估。組間和組內平行實驗的結果表明，該平臺展現出優異的重復性。通過與未石墨化的HP-Z67、ZIF-67以及石墨化的GC-Z67進行比較，發現只有石墨化后的材料（HPGC-Z67和GC-Z67）表現出顯著的N-糖檢測能力。得益于更高的石墨化程度和層級互連的多孔結構，HPGC-Z67產生的信號強度高于GC-Z67。

進一步比較了HPGC-Z67和GC-Z67對低濃度N-糖的富集和檢測性能。結果表明，在富集的N-糖數量及其信號強度方面，HPGC-Z67均優于GC-Z67。特別是在超低濃度0.1 ng μL^?1下，HPGC-Z67仍能檢測到8個N-糖，而GC-Z67僅檢測到2個。這種卓越的分析性能歸因于更高的碳石墨化度改善了與N-糖的相互作用，更大的表面積提供了豐富的N-糖吸附位點，以及層級互連的多孔結構促進了N-糖在通道內的擴散和保留。

考慮到HPGC-Z67的分級通道結構具有通過尺寸排阻效應阻擋大分子干擾物的潛力，研究探索了其對更復雜樣品的檢測可行性。實驗證明，即使在富含蛋白質的環境中，HPGC-Z67平臺也能有效捕獲和檢測N-糖，而蛋白質信號幾乎被基線掩蓋，這驗證了通過設計具有分級通道結構的石墨化材料來實現糖肽靈敏和特異性檢測的策略。

對于大規模臨床應用，簡化、快速和易于操作至關重要。研究嘗試基于HPGC-Z67平臺改進N-糖釋放方案，用直接離心和洗滌步驟取代傳統的超濾步驟。結果表明，與傳統的超濾過程相比，基于HPGC-Z67平臺的方案顯著減少了離心時間（從32分鐘減少到僅6分鐘），并降低了每個血漿樣本約30元人民幣的超濾管成本。更重要的是，直接離心方案在富集的N-糖數量和強度比方面均優于非超濾測定和傳統超濾。最終，確定了最佳富集和檢測條件為：15 μL血漿消化物與20 μL材料（10 μg μL^?1）的比例，以及60分鐘的孵育和洗脫時間。

采用簡化的流程方案和優化的檢測條件，研究者使用HPGC-Z67平臺從150個血漿樣本中提取了N-糖譜。這些樣本來自分娩前的孕婦，并經過了臨床診斷，分為健康對照組（HC，n = 50）、ERMF組（n = 50）和CAM組（n = 50）。質譜數據處理后，共鑒定出71個N-糖，其中59個在三個組中均被檢測到。這些N-糖中89.8%為雜合或復雜糖基化類型，10.2%為高甘露糖類型，且47.5%含有超過四個N-乙酰葡糖胺殘基，顯示出高度分支的特征。

為了確保N-糖特征篩選和預測診斷模型的可靠性，研究者對質量對照組進行了批次變異評估，證實技術變異性遠小于生物樣本間變異。隨后，基于這59個N-糖，引入了邏輯回歸（LR）、支持向量機（SVM）、隨機森林（RF）和梯度提升（GB）四種機器學習模型進行分類性能評估。綜合評估顯示，梯度提升模型表現最佳。使用優化后的梯度提升模型，基于HPGC-Z67平臺提取的N-糖對HC、ERMF和CAM隊列進行了多元分類，各隊列均獲得了高AUC值。進一步的成對區分也在訓練集和驗證集中顯示出高AUC值。這些結果證明，HPGC-Z67平臺提取的血漿N-糖譜能夠實現對CAM和ERMF的快速、精確早期預警和診斷。

基于HPGC-Z67提取的59個N-糖特征所展現出的高分類效能，研究者致力于篩選與分娩發熱最密切相關的關鍵N-糖，特別是那些對于區分需要及時產前干預的CAM感染性發熱至關重要的糖型。通過特征重要性評分和p值小于0.05作為篩選標準，分別從HC/發熱組和CAM/ERMF組中篩選出關鍵N-糖特征。

0.05; *, p < 0.05; , p < 0.01;, p < 0.001;***, p < 0.0001. (i) The confusion matrix for predicting HC/CAM/ERMF based on Feature Set 3 in the training set.">

最終，篩選出5個關鍵N-糖特征用于區分HC/發熱組（特征集1），以及另外5個關鍵N-糖特征用于區分CAM/ERMF組（特征集2）。特征集1在訓練集和驗證集中均成功實現了HC/發熱組的分類。特征集2對CAM/ERMF組的分類也獲得了顯著的區分性能，尤其在驗證集上達到了100%的準確性和特異性。這為實現產前手術孕婦不同病因發熱的及時、精確預警提供了可能。

對這些篩選出的關鍵N-糖的表達水平進行分析后發現，在HC/發熱預測中，多數關鍵N-糖特征在產時發熱組中上調。在發熱細分中，所有關鍵特征在CAM組中相對于非感染性ERMF均上調。糖型分析顯示，大多數血漿巖藻糖基化和唾液酸化N-糖水平在發熱組中升高。值得注意的是，巖藻糖基化N-糖與母體發熱（包括感染性和鎮痛誘導的發熱）之間存在關聯。有趣的是，兩個巖藻糖基化N-糖特征（m/z 1793.65 和 m/z 2305.24）同時出現在HC/發熱和CAM/ERMF分類模型中。進一步評估發現，m/z 1793.65的N-糖在HC和ERMF之間沒有明顯變化，但與CAM相比顯著上調，表明其與炎癥感染性發熱密切相關；而m/z 2305.24的N-糖在ERMF中相對于HC和CAM明顯下調，表明其與非感染性發熱密切相關。這兩個特征被指定為特征集3。令人驚訝的是，僅基于這兩個潛在生物標志物（一個對感染性發熱敏感，一個對非感染性發熱敏感）的模型，能夠同時區分HC、CAM和ERMF組，在訓練集和驗證集中分別獲得了0.965和0.914的AUC值、86.7%和80.0%的準確率以及93.3%和90.0%的特異性。這些發現驗證了感染性發熱敏感和非感染性發熱敏感的N-糖特征對于HC、CAM和ERMF同時診斷預測的高度有效性。

本研究設計了一種層級多通道石墨化碳（HPGC-Z67）作為快速、靈敏的納米診斷平臺。通過精心的納米結構設計，HPGC-Z67具有高比表面積、高石墨化度以及互連的分級通道等優勢，能夠增強N-糖在分級通道內的保留和擴散。此外，借助其靈敏的糖檢測能力，HPGC-Z67納米診斷平臺能夠簡化實驗流程，與標準方法相比，每個樣本的處理時間減少約25分鐘，成本降低約30元人民幣。該平臺展示了從150個臨床血漿樣本中進行高通量、可重復N-糖譜分析的強大能力。結合機器學習，研究者從獲得的糖譜中篩選出包含八個關鍵N-糖的兩個特征集。這些關鍵N-糖不僅能夠準確區分發熱與健康狀態，還能區分感染性（CAM）和非感染性（ERMF）病因，在訓練和驗證隊列中所有AUC值均超過0.95。值得注意的是，僅基于兩個潛在生物標志物（一個感染性發熱敏感，一個非感染性發熱敏感N-糖）的模型，能夠同時區分HC、CAM和ERMF，并獲得了高AUC值。該HPGC-Z67納米診斷平臺為產時發熱的精準早期診斷和及時臨床干預提供了潛力，并將納米診斷技術的范圍擴展到了糖組學生物檢測領域。