細胞依賴表面受體感知胞外信號并啟動膜近端的信號傳導，這對于細胞增殖、分化和生存至關重要。然而，設計能夠感知并重編程受體活性以實現用戶定義功能的合成基因回路仍具挑戰性。針對這一難題，研究者開發了一種名為受體信號誘導轉錄(RESIT)的合成回路。該系統的核心設計基于受體激活介導的裂解蛋白酶互補以及膜錨定合成轉錄模塊的釋放，從而將膜定位的受體激活轉化為預設的轉錄程序。

RESIT系統的基本結構包含兩個膜定位的合成轉錄模塊。每個模塊包含一個N端膜定位結構域、一個蛋白酶切割位點(TCS)、一個截短的非活性DNA結合域(DBD)、一個裂解蛋白酶片段和一個相互作用域。當受體被激活時，兩個相互作用域(ID_a和ID_b)的接近會導致裂解蛋白酶(例如煙草蝕紋病毒蛋白酶TEVp)的兩個片段發生不可逆的互補組裝。隨后，活化的蛋白酶會切割其底物，使得兩個被膜錨定的、截短的DBD發生穩定的同源二聚化，并釋放出能夠激活轉錄的合成模塊。這種設計將膜近端的生化相互作用事件高效地轉換成了可讀的基因表達信號。膜錨定的設計具有顯著優勢：它將反應物限制在二維膜表面而非三維胞質體積內，從而提高了局部的有效濃度，加速了反應動力學，并增強了信號檢測的靈敏度與空間選擇性。

2+內流的RESIT系統示意圖。受體激活后，ID_a和ID_b相互作用誘導裂解TEVp互補，導致膜錨定的轉錄調節因子重新組裝和釋放，從而誘導各種蛋白報告基因或效應因子的表達。(B) 對AP21967響應的RESIT系統示意圖。">

研究者首先使用一個模型系統——由小分子AP21967誘導的FKBP與FRB^T2098L之間的異源二聚化——來優化RESIT系統的通用部分。通過篩選不同截短程度的Gal4轉錄因子DBD變體，發現最優變體tGal4(65)能在AP21967誘導下實現高達103倍的熒光信號增強，同時背景極低。系統具有高度模塊化特性：它被證明可適配多種裂解病毒蛋白酶，如李痘病毒蛋白酶(PPVp)和大豆花葉病毒蛋白酶(SbMVp)，以及來自不同轉錄因子(如Gal4、TetR和GCN4)的DBD結構域，且這些正交的DBD能夠特異性激活其對應的報告基因。

Ca²⁺內流在機械轉導、分化和免疫等眾多生理過程中扮演關鍵角色。為了檢測質膜附近的Ca²⁺信號，研究者對RESIT系統進行了改造，將相互作用域分別替換為鈣調蛋白(CaM)和鈣調蛋白結合肽M13。當Ca²⁺通過陽離子通道進入細胞后，會介導CaM與M13的結合，從而觸發裂解蛋白酶互補和轉錄回路激活。

2+內流的RESIT系統設計。(A) 對Piezo1激活引發的Ca²⁺內流響應的RESIT系統示意圖。Piezo1激活介導的Ca²⁺內流誘導CaM?M13結合，從而互補裂解TEVp以啟動轉錄回路。">

該系統成功檢測了由PIEZO1激動劑Yoda1誘導的Ca²⁺內流，在PIEZO1陽性的HeLa細胞中顯示出強烈的熒光響應，且響應具有劑量依賴性。在PIEZO1陰性的HEK293T細胞中，只有在轉染PIEZO1表達質粒后才會出現響應，證明了系統的特異性。此外，該系統還能檢測由內質網Ca²⁺釋放(如毒胡蘿卜素TG誘導)以及組胺H1受體(H1R)激活所觸發的Ca²⁺內流。值得注意的是，膜錨定版本的RESIT比胞質定位的版本具有更高的檢測靈敏度，凸顯了其膜近端信號檢測的優勢。

更為引人注目的是，該系統被成功應用于檢測T細胞激活伴隨的Ca²⁺內流。研究者將RESIT系統包裝進慢病毒載體，轉導至Jurkat T細胞中。當這些T細胞與表達不同水平HER2的腫瘤細胞在雙特異性T細胞銜接器(BiTE，由HER2納米抗體和CD3單鏈可變片段scfv組成)存在下共培養時，RESIT系統分泌的熒光素酶報告基因活性與T細胞的激活程度(通過CD69上調證實)呈正相關，且響應依賴于BiTE介導的特異性識別。這證明了RESIT系統能夠將復雜的免疫細胞激活信號轉化為可量化的轉錄輸出。

受體酪氨酸激酶(RTK)的異常激活與多種癌癥密切相關。為了探測RTK活性，研究者以表皮生長因子受體(EGFR)為模型，重新設計了RESIT系統。其中一個轉錄模塊引入了與EGFR靠近的VAV1蛋白的SH2結構域，并連接一個底物肽基序(NPXY)；另一個模塊則包含磷酸酪氨酸結合域(PTB)。當EGFR被激活時，其自磷酸化為鄰近的NPXY基序提供了磷酸化位點，磷酸化的NPXY進而與PTB結構域結合，從而誘導蛋白酶互補和轉錄激活。

b)并介導其與PTB結構域(ID_a)的相互作用，誘導裂解TEVp互補和轉錄回路啟動。">

該RTK響應型RESIT系統在EGF刺激的HeLa細胞中顯示出強烈的熒光信號增強。通過使用無法結合磷酸化底物的PTB突變體或突變的底物基序(NPXF)進行對照實驗，證實了系統的特異性依賴于底物的磷酸化及其與PTB的結合。此外，SH2結構域對于將底物招募至EGFR附近以實現高效磷酸化至關重要。系統對不同細胞系(HEK293T、MCF-7、HeLa、SKOV3和A549)內源性RTK活性的檢測結果，與通過蛋白質印跡(WB)測得的EGFR磷酸化水平一致。同樣，膜錨定設計對于實現高信噪比至關重要，因為胞質版本的RESIT在EGF誘導下僅產生微弱的熒光增強。

Ras是位于EGFR下游的關鍵小GTP酶，其突變與許多癌癥有關。為了檢測Ras活性，研究者將RESIT系統的相互作用域分別替換為Ras蛋白(缺失C端以允許膜錨定)和其效應蛋白Raf1的Ras結合結構域(Raf1)。激活的Ras與Raf1結構域結合，從而觸發RESIT回路的激活。

a)與Raf1(ID_b)相互作用，介導裂解TEVp互補以啟動轉錄回路。">

該系統成功檢測了HeLa細胞中EGF誘導的Ras活性上調。利用該系統評估不同Ras熱點突變體(G12C、G12D、G13D、Q61L和S17N)的組成型活性，發現G12C、G12D、G13D和Q61L突變體即使在無EGF刺激下也表現出高基礎活性，而S17N突變體則活性極低，這與文獻報道一致。此外，該系統被用于評估Ras抑制劑的療效。結果顯示，MRTX1133能特異性抑制Ras G12D突變體的活性，而對其他突變體無效，證實了其等位基因特異性；而RMC-7977則能廣泛抑制所有測試的Ras突變體活性，表明其是一種廣譜抑制劑。這些實驗證明了RESIT系統在活細胞中實時評估Ras突變體活性和篩選靶向療法方面的潛力。

鑒于RTK的持續激活是許多癌癥的標志，研究者進一步將RTK響應型RESIT系統改造為治療性程序，用于特異性殺傷或調控高RTK活性的細胞。

首先，他們將報告基因替換為凋亡誘導蛋白hBax，構建了能誘導細胞凋亡的RESIT系統。在EGFR高表達的細胞(如A549、SKOV3)中，該系統成功誘導了顯著的細胞凋亡(Annexin V陽性細胞比例升高)，而在低表達EGFR的細胞(如MCF-7、HEK293T)中則幾乎沒有影響，實現了基于RTK活性的細胞特異性殺傷。

其次，他們將報告基因替換為一種可分泌的雙特異性溶酶體靶向嵌合體(LYTAC)，該分子由靶向EGFR的納米抗體和靶向胰島素樣生長因子2受體(IGF2R)的計算設計肽Endotag2組成。在RTK活性高的細胞中，RESIT系統誘導LYTAC的分泌，進而介導細胞表面EGFR的內吞和降解。結果顯示，在A549和SKOV3細胞中，EGFR降解效果最為明顯，且依賴于Endotag2的存在。

最后，他們將報告基因替換為一種可分泌的雙特異性T細胞銜接器(BiTE)，由EGFR納米抗體和CD3 scfv組成。當表達該RESIT系統的腫瘤細胞(具有高RTK活性)與Jurkat T細胞共培養時，分泌的BiTE能橋接腫瘤細胞和T細胞，特異性激活T細胞，表現為CD69和IL-2的上調以及細胞間的密切接觸。而僅分泌CD3 scfv的對照組則不能有效激活T細胞。這種設計展示了利用RESIT系統在腫瘤微環境中局部招募并激活T細胞進行免疫治療的潛力。

RESIT系統為感知膜定位受體激活并將膜近端信號重編程為預設的轉錄程序提供了一個通用平臺。其模塊化設計使其能夠適配不同的DBD和裂解蛋白酶，并成功應用于檢測Ca²⁺內流、RTK活性和Ras活性等多種生物學過程。更重要的是，該系統可被重編程以在特定細胞背景下執行凋亡、靶蛋白降解和免疫細胞激活等治療功能，展示了其在基礎研究和治療開發中的廣泛應用前景。該系統依賴于時間整合的轉錄進行信號放大，這與實時響應的熒光蛋白傳感器不同，但可能對記錄瞬態信號事件具有獨特優勢。未來，通過選擇具有不同親和力的相互作用對，可以調節系統的靈敏度。理論上，RESIT可以進一步擴展用于感知其他涉及蛋白質-蛋白質相互作用的受體信號通路。此外，利用已構建的正交轉錄因子，有望設計多重響應的RESIT系統，以實現對多種輸入信號的邏輯控制。總之，RESIT系統的模塊化和通用性有望極大擴展我們探究膜近端受體信號傳導以及將失調的受體激活重編程為強大治療工具的能力。