結(jié)構(gòu)性正常心臟的年輕個(gè)體發(fā)生心源性猝死（SCD）是亟待解決的臨床難題，通常由遺傳性心律失常綜合征（心臟離子通道病）引起。兒茶酚胺敏感性多形性室性心動(dòng)過(guò)速（CPVT）可在腎上腺素能刺激下引發(fā)致命性心律失常。盡管臨床證據(jù)已表明心臟交感神經(jīng)去神經(jīng)支配具有挽救生命的療效，但現(xiàn)有的治療干預(yù)主要仍以心肌細(xì)胞（CMs）為靶點(diǎn)。為理解這一治療悖論，研究團(tuán)隊(duì)利用來(lái)自健康個(gè)體和CPVT患者的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC），分化出心肌細(xì)胞和交感神經(jīng)元（SNs），并構(gòu)建了二維和三維微組織模型來(lái)研究神經(jīng)-心臟相互作用。團(tuán)隊(duì)假設(shè)CPVT也是一種自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本研究使用了來(lái)自健康對(duì)照和CPVT患者的多株hiPSC細(xì)胞系，通過(guò)特定的分化方案分別誘導(dǎo)產(chǎn)生hiPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）和交感神經(jīng)元（hiPSC-SNs）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色驗(yàn)證了細(xì)胞特異性標(biāo)志物的高表達(dá)率（例如，心肌細(xì)胞的肌鈣蛋白T（cTnT）和肌球蛋白輕鏈2v（MLC2v），神經(jīng)元的酪氨酸羥化酶（TH））。團(tuán)隊(duì)還建立了二維單層共培養(yǎng)和三維微滴打印的神經(jīng)-心臟共培養(yǎng)模型。功能表征手段包括單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq）、鈣成像、膜片鉗、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、微電極陣列（MEA）、光學(xué)標(biāo)測(cè)和快速掃描循環(huán)伏安法（FSCV）等。

流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，超過(guò)80%的分化心肌細(xì)胞同時(shí)表達(dá)cTnT和MLC2v，80-90%的分化細(xì)胞表達(dá)TH。單細(xì)胞RNA測(cè)序分析進(jìn)一步揭示了細(xì)胞異質(zhì)性，確認(rèn)了心肌細(xì)胞（表達(dá)^ACTC1、^MYL4等）和交感神經(jīng)元（表達(dá)^GAL、^VIP、^NOS1等）的特定集群，并在SNs中檢測(cè)到^TH、^RYR2和^KCNQ2/3/5等基因的表達(dá)。

電生理特性： 膜片鉗記錄顯示，與健康對(duì)照相比，CPVT hiPSC-SNs具有顯著更高的放電頻率和放電次數(shù)，并且更多表現(xiàn)為緊張性放電模式。

鈣瞬變、cAMP信號(hào)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放： 鈣成像表明，在尼古丁、咖啡因或高鉀刺激下，CPVT-SNs的細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變幅度顯著增強(qiáng)。FRET實(shí)驗(yàn)顯示，CPVT-SNs在尼古丁刺激后產(chǎn)生的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平升高更顯著。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和快速掃描循環(huán)伏安法（FSCV）測(cè)量去甲腎上腺素（NA）釋放，發(fā)現(xiàn)CPVT神經(jīng)元有釋放更多NA的趨勢(shì)，盡管差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

CPVT hiPSC-CMs表現(xiàn)出不規(guī)則節(jié)律： 微電極陣列記錄顯示，基線狀態(tài)下，47%的CPVT hiPSC-CMs表現(xiàn)出心律失常（如心動(dòng)過(guò)速和折返現(xiàn)象），而對(duì)照組則無(wú)。規(guī)則跳動(dòng)的心肌細(xì)胞中，CPVT組的RR間期和場(chǎng)電位時(shí)程（FPD）縮短。

不協(xié)調(diào)的鈣釋放和增強(qiáng)的cAMP反應(yīng)： 鈣成像顯示，CPVT hiPSC-CMs對(duì)異丙腎上腺素、高鉀或咖啡因刺激表現(xiàn)出增強(qiáng)的鈣瞬變，并且在刺激后常出現(xiàn)不規(guī)則的自發(fā)性鈣釋放（后除極）。FRET實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CPVT hiPSC-CMs在異丙腎上腺素刺激下cAMP水平的升高顯著高于對(duì)照組。

單細(xì)胞RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)CPVT神經(jīng)元中^KCNQ2/3表達(dá)發(fā)生變化。使用M電流（_IM）抑制劑XE-991可增加對(duì)照神經(jīng)元的興奮性并降低其閾值；而使用M電流激活劑瑞替加濱則可降低CPVT神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率并提高其閾值。計(jì)算模型模擬證實(shí)，上調(diào)M電流電導(dǎo)可以重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中觀察到的神經(jīng)元興奮性降低。

免疫熒光證實(shí)了心肌細(xì)胞和交感神經(jīng)元在共培養(yǎng)中的共存。鈣成像顯示，無(wú)論與健康還是CPVT心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，CPVT神經(jīng)元的鈣瞬變幅度均高于對(duì)照組神經(jīng)元。微電極陣列記錄表明，尼古丁刺激能加速神經(jīng)-心臟共培養(yǎng)中心肌細(xì)胞的跳動(dòng)頻率，且與CPVT神經(jīng)元共培養(yǎng)的健康心肌細(xì)胞，其RR間期縮短更為顯著。

研究采用微流控液滴打印技術(shù)，成功制備了直徑約600 μm的3D心肌和交感神經(jīng)微組織。這些微組織在培養(yǎng)數(shù)天后開(kāi)始自發(fā)收縮，共培養(yǎng)后可見(jiàn)神經(jīng)元突起向心肌微組織內(nèi)生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)和功能的整合。

在3D CPVT微組織中觀察到不規(guī)則的鈣活動(dòng)： 光學(xué)標(biāo)測(cè)顯示，健康的CM微組織呈現(xiàn)平滑的激活圖和正常波形，而多數(shù)CPVT微組織則表現(xiàn)出不規(guī)則、振蕩樣的激活圖和多峰波形。CPVT微組織的鈣瞬變幅度（CaTA）和鈣瞬變衰減至峰值70%的時(shí)程（CaTD₇₀）均顯著增加。

健康CMs的鈣活動(dòng)受CPVT SNs調(diào)節(jié)： 在3D共培養(yǎng)體系中，與健康SNs共培養(yǎng)相比，與CPVT-SNs共培養(yǎng)的健康心肌微組織在尼古丁刺激后，表現(xiàn)出心率降低、鈣瞬變時(shí)程（CaTD₇₀）顯著延長(zhǎng)，并出現(xiàn)典型CPVT病理特征的多峰鈣振蕩波形，表明CPVT交感神經(jīng)元的功能異常足以誘發(fā)健康心肌組織的致心律失常活動(dòng)。

本研究通過(guò)創(chuàng)新的人源心臟-神經(jīng)微組織模型，首次提供了直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)，表明CPVT的病理表型同樣存在于交感神經(jīng)元中。CPVT-SNs表現(xiàn)出與病變心肌細(xì)胞類(lèi)似的鈣處理異常、cAMP信號(hào)增強(qiáng)和超興奮性。更重要的是，病變神經(jīng)元能直接觸發(fā)健康心肌細(xì)胞的致心律失常活動(dòng)。單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示了SNs中神經(jīng)遞質(zhì)通路的失調(diào)，并識(shí)別出諸如M電流通道等可成藥的分子靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)解釋了為何手術(shù)切斷交感神經(jīng)（心臟交感神經(jīng)去神經(jīng)支配術(shù)）對(duì)CPVT患者有效，并將神經(jīng)系統(tǒng)確立為一個(gè)新的治療靶標(biāo)。研究進(jìn)一步提出，CPVT不應(yīng)僅僅被視為心肌細(xì)胞疾病，而應(yīng)被重新定義為一種神經(jīng)-心臟疾病，這為開(kāi)發(fā)針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)調(diào)控療法開(kāi)辟了新途徑。