開發了一種基于TaqMan探針的qPCR檢測方法，用于檢測引起斑節對蝦（Litopenaeus vannamei）幼體后期透明病（TPD）的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）
《Journal of Invertebrate Pathology》：Development and a TaqMan probe-based qPCR assay for
Vibrio parahaemolyticus causing translucent post-larvae disease (TPD) detection in
Litopenaeus vannamei
編輯推薦：
Pacific white shrimp養殖面臨由高毒力Vibrio parahaemolyticus（攜帶vhvp-2基因）引起的透明后幼體病（TPD）威脅，本研究開發vhvp-2靶向TaqMan qPCR檢測方法，靈敏度達14.64拷貝/反應，特異性100%，抗基質干擾能力強，優于前期SYBR Green法但成本更高，形成互補檢測體系。
作者：賈欣、張璐、李欣軒、曾啟凡、胡靜潔、鮑振民、王夢強
中國廣東省南方海洋科學與工程實驗室（廣州），郵編511458
摘要
太平洋白蝦（Litopenaeus vannamei）的水產養殖業面臨著由新發現的高毒力Vibrio parahaemolyticus（VpTPD）引起的透明后幼體病（TPD）的嚴重威脅，這種細菌攜帶關鍵的vhvp-2毒力基因。因此，建立一種快速、準確的檢測方法對于該疾病的初步診斷和有效管理至關重要。本研究開發了一種基于TaqMan探針的vhvp-2靶向qPCR檢測方法，用于快速檢測VpTPD。通過嚴格優化，該方法實現了14.64個拷貝/反應的檢測限，具有高擴增效率（E = 109.25%）和強線性相關性（R2 = 0.9916），并且與六種主要蝦類病原體無交叉反應。該方法在高背景DNA濃度（≤ 2000 ng/μL）下表現出良好的抗干擾能力，對104個樣本（100只感染蝦和4只健康蝦）的臨床驗證顯示100%的診斷靈敏度和特異性，測試結果與實際感染狀態完全一致。與之前建立的基于SYBR Green的qPCR方法相比，該方法具有明顯優勢：基于SYBR Green的方法檢測限為10?個拷貝/反應，而基于TaqMan的方法具有更強的抗干擾能力和更短的分析周轉時間。值得注意的是，TaqMan探針的合成成本是SYBR Green試劑的10倍。這些實驗數據表明，基于TaqMan探針的qPCR方法具有高精度，適用于確認性實驗室診斷，而基于SYBR Green的qPCR方法則適用于大規模現場篩查。這種雙方法框架為不同水產養殖環境中的TPD預防和檢測提供了全面的解決方案。
引言
隨著亞洲海鮮消費量的增加，水產養殖在2022年超過了捕撈漁業，成為全球水生動物的主要來源，其中中國貢獻了36%的產量（Roy等人，2024年）。這一增長在中國蝦產業中尤為明顯，到2020年中國已成為全球最大的蝦生產國（N’Souvi等人，2024年）。其中，太平洋白蝦（Litopenaeus vannamei）由于生長速度快和經濟效益高，成為中國海水養殖中發展最快的物種，占中國養殖蝦產量的80%–90%（Fu等人，2024年）。然而，各種病毒和細菌病原體在水產養殖中的高流行率和致死性一直限制著L. vannamei養殖的可持續發展（Lee等人，2022年；李和向，2013年）。2019年秋季，中國沿海的大規模L. vannamei養殖場出現了一種新疾病，主要感染孵化后6至12天的后幼體（PL6–PL12）（Harkell，2020a；Harkell，2020b）。受感染的L. vannamei表現出嗜睡、體色變暗以及肝胰腺異常（邊緣模糊和變色），隨后出現胃腸道空虛，導致90%–100%的急性死亡率（賈等人，2024年；2025年）。由于患病蝦體出現玻璃樣病變，當地農民將這種疾病稱為透明后幼體病（TPD）（Yang等人，2022年）。這種疾病對全國蝦苗場造成了巨大的經濟損失，使其成為當代蝦類養殖中的一個新興威脅。
研究人員在全國范圍內對TPD的病因進行了監測，對五個主要水產養殖省份進行了系統的現場采樣和流行病學調查以分離病原體（Zou等人，2020年）。實驗室檢測排除了由傳染性皮下和造血壞死病毒（IHHNV）、黃頭病毒（YHV）、白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性肌壞死病毒（IMNV）、Taura綜合征病毒（TSV）以及引起急性肝胰腺壞死病（VpAHPND）的Vibrio parahaemolyticus引起的感染（Yang等人，2022年；Zou等人，2020年）。后續的病原體分離、組織病理學分析和實驗挑戰證實，TPD主要是由V. parahaemolyticus（VpTPD）引起的，這是一種具有三類毒力基因的細菌病原體（Liu等人，2023年）。基因組篩查發現三個串聯毒力基因：Vibrio高毒力蛋白1基因（vhvp-1）、Vibrio高毒力蛋白2基因（vhvp-2）和Vibrio高毒力蛋白3基因（vhvp-3），這些基因位于一個187,791 bp的質粒上（賈等人，2025年）。在挑戰實驗中，僅攜帶vhvp-1基因而不攜帶vhvp-2基因的VpTPD菌株未能在L. vannamei后幼體中產生致死性，而僅攜帶vhvp-2基因的菌株表現出與VpTPD相當的致死性（Liu等人，2023年）。后續研究表明，單獨存在vhvp-1基因或與vhvp-3基因共存都與致病性無關。然而，在毒力菌株中同時檢測到vhvp-2和vhvp-3基因后，推測vhvp-3基因可能在vhvp-2基因介導的高毒力表型中起輔助作用（賈等人，2025年）。雖然vhvp-3基因的精確致病機制需要進一步研究，但vhvp-2基因編碼的Vibrio高毒力蛋白2（VHVP-2）被確定為VpTPD致病性的主要毒力因子（Liu等人，2023年；張等人，2024年；賈等人，2025年）。
關于Vibrio菌株中vhvp-2基因的傳播機制及其在致病菌株進化中的作用，目前仍不完全清楚，需要進一步研究（賈等人，2023年）。為了防止VpTPD的進一步傳播，L. vannamei養殖業迫切需要快速有效的控制措施。與耗時的酶聯免疫吸附測定（ELISA）和相對昂貴的基因測序相比，核酸擴增技術具有反應時間短、操作簡單和適用范圍廣等優點（Gong等人，2021年）。在這些擴增方法中，實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）在檢測速度、靈敏度和結果可靠性方面優于傳統PCR，使其成為相關應用中最廣泛采用的技術之一（Gasparic等人，2010年）。在之前的工作中，我們開發了三種基于SYBR Green的qPCR檢測方法，能夠特異性檢測位于187,791 bp質粒上的vhvp-1、vhvp-2和vhvp-3基因（賈等人，2026年）。對這些方法的比較評估顯示，針對vhvp-2基因的檢測方法具有更高的靈敏度和穩定性（賈等人，2026年）。然而，基于SYBR Green的qPCR方法基于染料與雙鏈DNA（dsDNA）的相互作用，容易產生引物二聚體和非特異性擴增產物，因此需要熔解曲線分析來驗證擴增特異性（Cruz-Flores等人，2019年；張等人，2023年）。相比之下，基于TaqMan探針的qPCR方法通過捕獲延伸階段探針水解釋放的熒光信號實現精確檢測，有效避免了非特異性干擾（Tajadini等人，2014年）。鑒于基于TaqMan探針的qPCR的優越性和vhvp-2基因作為檢測目標的重要性，本研究的主要目標是開發相應的TaqMan檢測方法，并將其性能與已建立的SYBR Green方法進行比較。這項工作為VpTPD的快速檢測和早期干預提供了更穩健的方法學基礎。
在本研究中，我們建立了一種基于TaqMan探針的qPCR檢測方法，針對vhvp-2基因，以實現VpTPD的快速檢測。通過檢測優化以及靈敏度、特異性和穩健性的評估，該方法證明了其在實驗室環境中實時檢測臨床樣本的能力。此外，該方法為水產養殖設施的高通量篩查和預防應用提供了實用工具。
部分內容片段
蝦樣本和病原體準備
用于試驗的蝦樣本是在我們的實驗條件下實驗室培育的。使用TIANamp Marine Animals DNA Kit（DP 324，TianGen，中國）從肝胰腺中提取總DNA。VpTPD、WSSV、IHHNV、甲殼類動物信使壞死病毒（CMNV）、TSV和Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）由我們的實驗室提供并維持。蝦樣本和病原體懸浮液均儲存在-80 ℃。
重組質粒構建
選擇vhvp-2基因的ORF1b片段作為目標
引物篩選
使用常規PCR擴增了七對引物，根據瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1），初步選擇了四對沒有非特異性擴增且擴增效率高的引物（TPD-F1 / TPD-R1、TPD-F2 / TPD-R2、TPD-F4 / TPD-R4和TPD-F7 / TPD-R7）。隨后，這四對引物通過基于TaqMan探針的qPCR檢測進行了進一步篩選，選擇Ct值最低且熒光信號最強的引物對。
討論
L. vannamei是全球水產養殖中最重要的海鮮物種之一（李等人，2018年；田等人，2024年）。由于其巨大的經濟價值和市場需求，其養殖規模在中國和東南亞國家顯著擴大（李和向，2013年）。然而，由弧菌病爆發引起的嚴重經濟損失一直阻礙著這些地區的產業發展（Roy等人，2020年）。TPD是一種由VpTPD引起的新型細菌性疾病
CRediT作者貢獻聲明
賈欣：撰寫 – 原始草稿，研究。
張璐：方法學，研究，資金獲取。
李欣軒：研究。
曾啟凡：資金獲取。
胡靜潔：項目管理。
鮑振民：監督，資金獲取。
王夢強：撰寫 – 審稿與編輯，監督，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
致謝
本工作得到了河北省創新能力提升項目（253A6701D）、海南省科技創新人才項目（KJRC2025B14）以及三亞亞洲灣科技城博士研究創新基金聯合項目（HSPHDSRF-2024-02-007）的支持。
