《Immunity, Inflammation and Disease》：An In Silico Omics Investigation of the Lactobacillus Genus Complex for Allergenicity Mitigation
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本文通過計算機組學方法，對161個乳酸桿菌屬參考菌株的基因組和蛋白質組進行了系統性分析，旨在篩選具有緩解過敏性疾病潛力的益生菌候選株。研究重點評估了核苷酸免疫抑制基序（NISM）的豐度、細胞色素P450（CYP450）酶的存在以及潛在致敏性蛋白表位。結果表明，清酒乳桿菌（Latilactobacillus sakei）在NISM密度、CYP450酶存在且無穩定致敏表位方面表現突出，是潛在的抗過敏益生菌優選菌株。本研究為功能性益生菌的開發提供了重要的生物信息學篩選依據。
1 引言
在調節免疫反應的諸多方法中，益生菌是重要的一員。微生物群的微妙平衡對維持免疫穩態至關重要，而這種平衡受生活方式和飲食習慣的影響。失衡可能導致食物過敏等疾病的發展。乳酸桿菌等益生菌可以通過多種機制調節免疫，包括產生抗菌代謝物、競爭抑制病原菌、增強上皮屏障功能等。特別是，益生菌中的某些特定成分，如核苷酸免疫抑制基序（NISM）或某些代謝物（如17,18-環氧二十碳四烯酸，17,18-EpETE），顯示出降低過敏反應發生率的潛力。然而，一些細菌蛋白本身也可能具有致敏性或引發交叉反應。因此，本研究旨在通過計算機組學分析方法，對乳酸桿菌屬復合體的基因組和蛋白質組進行全面分析，以識別具有緩解過敏潛力且安全的菌株。
2 材料與方法
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2.1 數據收集
研究分析了來自乳酸桿菌屬復合體的161個參考基因組和蛋白質組，數據來源于UniProt和NCBI等公共數據庫。分析涵蓋了乳酸桿菌（Lactobacillus）、乳酸乳桿菌（Lacticaseibacillus）、粘液乳桿菌（Limosilactobacillus）、清酒乳桿菌（Latilactobacillus）等多個相關屬的物種。
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2.2 核苷酸免疫抑制基序的鑒定
采用系統方法鑒定了乳酸桿菌基因組中NISM的存在。通過計算每百萬堿基對的基序密度（Motif Per Million, MPM），并將其與潛在的免疫調節效應相關聯。使用EMBOSS和MAST等生物信息學工具，分析了包括TCAAGCTTGA、TTAGGG等在內的17個已知NISM在161個基因組中的分布。
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2.3 蛋白質分析與致敏性預測
為評估乳酸桿菌基因組編碼蛋白的潛在致敏性，使用了AlgPred2.0、IEDB和AllergenOnline等預測工具。這些工具基于序列特征、IgE表位比對等方法，評估蛋白質的致敏潛力和交叉反應性，以識別致敏性表位。
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2.4 消化酶影響評估
使用PeptideCutter工具模擬胃腸道消化酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）的切割作用，評估預測出的致敏性表位在消化過程中的穩定性。那些在消化后仍能保持完整的“穩定致敏性表位”被認為是潛在的風險因素。
3 結果
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3.1 排名前十的核苷酸免疫抑制基序
在分析的乳酸桿菌物種中，NISM的MPM值排名前十的物種包括：清酒乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、瘤胃乳桿菌（Lactobacillus ruminis）、粘液粘液乳桿菌（Limosilactobacillus mucosae）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）、短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）等。其中，清酒乳桿菌的NISM密度較高。
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3.2 菌株篩選與數據獲取
初步篩選后，最終確定了161個具有高質量參考蛋白質組的乳酸桿菌物種和菌株用于分析。
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3.3 致敏原和穩定表位的鑒定
利用AlgPred2.0、IEDB和AllergenOnline預測了所選乳酸桿菌物種的致敏性表位，并使用PeptideCutter預測了穩定致敏性表位。在總計53,438個蛋白中，共鑒定出557個致敏性表位，其中僅有17個在模擬消化后保持穩定。具體而言，在NISM排名前十的物種中，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）等含有的致敏性表位數量較多，而嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的數量最少（10個）。在穩定表位方面，副干酪乳桿菌、短乳桿菌和羅伊氏粘液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）分別有2、2和1個穩定表位，而清酒乳桿菌則未發現任何穩定致敏性表位。
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3.4 細胞色素P450的檢測
研究發現，在分析的乳酸桿菌屬復合體中，僅在清酒乳桿菌和Secundilactobacillus acidipiscis的基因組中檢測到了細胞色素P450（CYP450）基因的存在，其他物種中則未發現。
4 討論
過敏可由多種來源引發，食物過敏尤其與Th2型免疫反應失衡有關。益生菌中的NISM可能有助于糾正這種失衡。本研究篩選出的高NISM密度菌株具有此潛力。此外，ω-3多不飽和脂肪酸（PUFA）具有免疫抑制和抗炎作用。其中，代謝產物17,18-EpETE被證實可抑制食物過敏發展。CYP450酶是催化EPA生成17,18-EpETE的關鍵酶。因此，在清酒乳桿菌中發現CYP450基因，意味著其可能具備產生這種抗過敏脂質介質的能力。
既往研究支持了清酒乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等不同菌株的免疫調節潛力，但效果具有菌株特異性。本研究通過計算機分析，不僅突出了乳酸桿菌屬內免疫調節潛能的多樣性，還提供了一個篩選安全有效菌株的基礎框架。清酒乳桿菌因其高NISM密度、存在CYP450基因且無穩定致敏性表位，成為特別有前景的候選菌株。
同時，研究也指出了計算機分析的局限性。致敏性預測主要針對IgE介導的機制，未能涵蓋T細胞介導的反應。菌株的免疫調節潛力是其產生的各種代謝物（如短鏈脂肪酸、免疫調節肽）綜合平衡的結果，且受腸道環境壓力（如低pH、消化酶）的影響，可能誘導“兼職蛋白”表達，從而改變表位的可及性。此外，CYP450基因的存在僅代表潛力，其功能表達和代謝產物的生成需要進一步實驗驗證。
5 結論
綜上所述，本計算機篩選研究將清酒乳桿菌確定為乳酸桿菌屬復合體中一個極具潛力的候選菌株，用于進一步的深入研究。其基因組特征（高NISM密度、存在CYP450基因、無穩定致敏性表位）表明其IgE介導的致敏風險較低，并可能通過產生抗炎代謝物來緩解過敏。早期臨床研究也支持攝入清酒乳桿菌對改善特應性濕疹-皮炎綜合征患兒的臨床癥狀有積極作用。
然而，必須強調的是，這一潛力需要通過功能實驗來驗證，以評估其在生理相關條件下的整體免疫調節輸出平衡。因此，雖然本研究提出了清酒乳桿菌作為未來研究的一個非常有希望的候選者，但仍需更多的實驗研究來全面了解其治療過敏性疾病潛力和安全性。未來的研究方向應包括：尋找生物標志物、對17,18-EpETE等代謝物進行機制研究、擴展比較基因組分析、交叉反應性研究以及臨床試驗。
