《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Investigating the Relationships Among Gut Microbiota, Inflammatory Cytokines, Cerebrovascular Diseases, and the Mediation Pathways
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這篇綜述通過孟德爾隨機化(MR)和中介分析方法，深入探究了腸道菌群(GM)與腦血管疾病(CeVD)之間的因果關聯，并首次闡明了炎癥因子在這一通路中的關鍵介導作用。研究發現了33種與CeVD顯著相關的腸道菌群物種和18種相關的炎癥細胞因子，并識別出10條由炎癥因子介導的“腸道菌群-CeVD”因果通路。這項工作為從腸道微生物-免疫軸角度理解CeVD的病理機制和開發新的防治策略提供了重要的遺傳學證據和潛在靶點。
引言
腦血管疾病(CeVD)是由腦血管異常導致腦組織血流中斷和損傷的一系列疾病，主要包括缺血性卒中(IS)、腦出血(ICH)和蛛網膜下腔出血(SAH)，占全球卒中病例的87%。CeVD是全球第二大死亡原因，隨著全球人口老齡化，其發病率不斷上升，對公共衛生構成日益嚴重的威脅。盡管疾病負擔沉重，其確切機制以及有效的預防和治療策略仍不甚明了。
腸道菌群是一個代謝活躍、分類多樣的生態系統，定植于人類胃腸道。研究表明，大腦與腸道菌群之間存在通過微生物-腸-腦軸實現的雙向聯系。腸道菌群及其代謝物通過調節氧化應激、細胞凋亡、神經炎癥等關鍵過程影響IS的發生發展。動物研究還表明，腸道菌群可通過調節中性粒細胞浸潤影響SAH后的早期腦損傷。另一方面，炎癥細胞因子是由免疫細胞產生的信號分子，在調節炎癥和免疫反應中起關鍵作用，與CeVD的發生和惡化密切相關。
然而，人體內復雜的相互作用使得在涉及腸道菌群、炎癥和CeVD的研究中難以測量混雜因素，且確定暴露與結局的時間順序具有挑戰性。為解決這些問題，本研究采用孟德爾隨機化(MR)這一流行病學方法，利用種系遺傳變異作為工具變量(IVs)，在滿足核心IV假設（相關性、獨立性、排他性）的前提下估計因果效應，同時考慮了多效性的潛在影響。此外，研究還采用中介分析來評估暴露對結局的影響如何通過中介變量傳遞，以闡明變量之間的潛在通路。
材料與方法
研究設計
本研究流程圖如圖1所示。研究從公開數據庫中獲取了腸道菌群、炎癥細胞因子和CeVD亞型的全基因組關聯研究(GWAS)匯總統計數據。通過兩樣本MR分析（包括正向/反向和多變量MR分析）評估這些性狀之間的因果關系，最終利用中介分析揭示炎癥細胞因子在腸道菌群-CeVD關聯中的介導作用。本研究遵循STROBE-MR指南。
數據來源
腸道菌群組成的GWAS匯總統計數據來自FINRISK 2022隊列（n=5959，歐洲血統），其基因組和宏基因組數據通過鳥槍法糞便測序生成，分析了近800萬個經過嚴格質量控制的遺傳變異，共涵蓋了6個分類級別（從門到種）的209個物種水平分類群。91種炎癥細胞因子的GWAS數據集來自公開的GWAS目錄，源自INTERVAL隊列（n=14,824，歐洲血統）。作為結局的CeVD亞型的GWAS數據集來自腦血管疾病知識門戶平臺，其中IS數據來自一項涉及521,612名個體的多血統GWAS，ICH和SAH的遺傳變異則來自對UK Biobank和FinnGen隊列的薈萃分析。
工具變量選擇
研究選取與腸道菌群和炎癥細胞因子顯著相關的單核苷酸多態性作為IVs，顯著性閾值設為p<1e-05。為減少連鎖不平衡帶來的潛在偏倚，應用了PLINK軟件中的聚類程序。為避免弱工具變量偏倚，保留了F統計量大于10的IVs。
MR分析
本研究采用逆方差加權(IVW)薈萃回歸作為主要分析方法。為減少多重比較帶來的I型錯誤，對主要IVW結果進行了錯誤發現率校正。同時，還應用了其他幾種MR方法，包括最大似然法、MR-穩健調整剖面評分和貝葉斯加權MR。不同方法結果的一致性支持了觀察到的因果效應的穩健性。研究還進行了Cochran Q檢驗以評估異質性，并使用MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗來評估水平多效性。此外，進行了多變量MR分析，以控制可能影響結局的潛在混雜因素（如血壓、吸煙、飲酒）。
中介分析
為探究腸道菌群影響CeVD的機制，研究以炎癥細胞因子為中介進行了中介分析。第一步是估計基因決定的腸道菌群對炎癥細胞因子的因果效應（β1），隨后估計炎癥細胞因子對CeVD亞型的因果效應（β2）。使用Delta方法從兩樣本MR分析中推導出標準誤。
結果
腸道菌群與CeVD的因果關系
IVW分析在p<0.05水平上揭示了33種腸道菌群物種與CeVD之間的顯著因果關系，涉及5個不同的腸道菌群門。研究發現，糞便圓柱菌、普羅文斯桿菌等4種菌的豐度增加與IS風險升高顯著正相關；而阿里斯蒂普斯沙氏菌、梭狀芽孢桿菌、普雷沃菌等5種菌的基因水平升高則與IS的保護作用相關。研究還探討了14種和10種腸道菌群物種分別與ICH和SAH的因果關系，但這些關聯在經過多重比較校正后失去了顯著性。所有結果的F統計量均大于10，表明不存在弱工具變量偏倚。使用不同的MR方法也識別出了一致的因果關聯
Cochran Q檢驗顯示IVs間無異質性證據，MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗共同證實不存在方向性水平多效性。留一法分析進一步表明，排除任何單個IV都不會對結果產生實質性影響。反向MR分析未發現CeVD對腸道菌群組成有因果效應，排除了雙向因果關系的可能性。敏感性分析證實了所有四種MR方法的穩健性。此外，多變量MR分析在控制了超過兩個混雜因素后，識別出6種與CeVD風險顯著相關的腸道菌群物種
炎癥細胞因子與CeVD的因果關系
基于IVW方法的結果，研究識別出7種與IS相關、5種與ICH相關、6種與SAH相關的炎癥細胞因子。例如，CD5豐度增加與ICH風險升高相關；而AXIN1、CXCL9、基質金屬蛋白酶-10和程序性死亡配體1(PD-L1)水平升高被發現對ICH具有保護作用。這些結果的F統計量范圍表明不存在弱工具變量偏倚
留一法分析確認沒有IVs顯著影響結果。然而，經過敏感性分析，由于觀察到IVs的異質性和方向性水平多效性的證據，排除了5種炎癥細胞因子（4種與IS相關，1種與SAH相關）。所有方法均未發現反向因果關系的證據，敏感性分析也證實了零反向MR結果的穩健性。
中介分析
中介分析量化了由炎癥細胞因子介導的腸道菌群-CeVD因果通路所占的比例，具體檢驗了間接效應：腸道菌群→細胞因子→CeVD。分析僅納入了在主要MR分析中顯示出對CeVD有因果效應的微生物分類群和細胞因子。
研究共識別出10種中介關系。從腸道菌種嗜黏蛋白阿克曼菌B到ICH的通路分別由MMP-10和PD-L1介導，分別貢獻了7.46%和7.04%的效應。此外，三種炎癥細胞因子——MMP-10、PD-L1和腫瘤壞死因子——介導了多種關系。例如，MMP-10水平介導了嗜黏蛋白阿克曼菌B、GCA-900066755 sp900066755和普雷沃菌sp000436915與ICH之間的關聯，中介效應分別為7.46%、8.08%和13.96%
討論
本研究通過MR分析，識別了33種微生物分類群對CeVD的因果效應。在調整了超過兩個混雜因素后，6種腸道菌群物種的因果關聯仍具有統計學意義。18種炎癥細胞因子表現出亞型特異性的因果效應。中介分析量化了炎癥蛋白介導的腸道菌群-CeVD因果通路，其中普雷沃菌sp000436915→MMP-10→ICH構成了主要的中介效應。
研究發現，作為厚壁菌門的一個物種，糞球菌在物種水平上可能充當ICH的保護因子，但其豐度增加似乎對SAH構成顯著風險。普雷沃菌屬包含50多個物種，其與疾病的關系存在爭議。本研究發現普雷沃菌sp002933775對IS有保護作用，而普雷沃菌sp000436915則似乎降低了SAH的風險。這些結果強調了需要從腸道菌群的角度研究不同普雷沃菌物種與特定疾病亞型的關系。
研究探討了MMP-10、PD-L1分別與ICH的負向因果關系。已有小鼠模型研究表明MMP-10能顯著縮短顱內再灌注時間、減小梗死面積，且與組織纖溶酶原激活劑相比出血時間更短、顱內出血事件更少，這支持了MMP-10是ICH保護因子的結果。PD-L1作為關鍵的免疫調節劑，已被證明可以減輕腦出血后的繼發性腦損傷。動物實驗也證明，PD-L1能改善炎癥環境，增強血腦屏障，減少ICH模型小鼠的腦水腫和出血量。這些證據支持了MMP-10和PD-L1是ICH發生保護因子的結論。
研究識別了嗜黏蛋白阿克曼菌B到ICH的通路由MMP-10和PD-L1介導的中介關系。雖然每個介導因子的單獨貢獻看似有限，但這些結果與現有關于腸道菌群在疾病中復雜作用的研究相符。重要的是，當多個中介因子共同考慮時，總的中介效應可以得到顯著增強。這突顯了MMP-10和PD-L1作為由嗜黏蛋白阿克曼菌形成的保護網絡中的關鍵節點的潛力。這些統計關聯似乎與生物學證據一致。MMP-10已被確定為驅動動脈粥樣硬化的關鍵分子，而PD-L1在ICH后的神經保護中起著核心作用。嗜黏蛋白阿克曼菌通常被視為長壽相關細菌的一員，已被證明可通過促進腸道菌群內部的平衡，對多種慢性疾病有益。可以推斷，嗜黏蛋白阿克曼菌B對CeVD發展的保護作用可能源于MMP-10和PD-L1的釋放。
本研究有幾個優勢。首先，與先前研究相比，我們的MR分析在更具體的腸道菌群物種水平上進行。其次，我們通過中介分析構建了由炎癥細胞因子介導的從腸道菌群到CeVD的因果通路，部分闡明了CeVD的發病機制。第三，應用多樣化的MR方法結合敏感性分析增強了研究結果的穩健性。當然，研究也存在一些局限性。例如，主要GWAS數據集的參與者多為歐洲血統，對其他種族的適用性需謹慎解讀；以及未能使用更大的MiBioGen聯盟數據進行驗證等。
結論
總而言之，通過MR分析，我們探索了腸道菌群、炎癥細胞因子與CeVD之間的因果關系。進一步的中介分析揭示了炎癥因子在連接腸道菌群與CeVD的通路中充當了中介角色。這些生物標志物有望為理解CeVD的潛在機制提供新的見解，并促進針對CeVD的靶向預防和治療策略的開發。
