人類牙齒發(fā)育是一個(gè)由上皮-間充質(zhì)相互作用驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜過程。然而，牙齒的自我修復(fù)能力有限，遺傳或環(huán)境因素造成的破壞可能導(dǎo)致牙胚發(fā)育受損，并最終導(dǎo)致全球范圍內(nèi)牙體硬組織損傷的高發(fā)病率。目前針對(duì)牙齒損傷的臨床治療主要依賴合成材料的粘接或固定修復(fù)體。因此，從分子生物學(xué)角度重新審視損傷后牙胚的修復(fù)是一個(gè)前景廣闊的研究方向。

斑馬魚的咽齒由腹側(cè)、中背側(cè)和背側(cè)三個(gè)不同的齒列組成。其牙齒發(fā)育經(jīng)歷起始、形態(tài)發(fā)生、早期細(xì)胞分化、晚期細(xì)胞分化和附著五個(gè)時(shí)空協(xié)調(diào)的階段。與哺乳動(dòng)物不同，斑馬魚牙齒的礦化表面由釉基質(zhì)（一種類似釉質(zhì)的原始高礦化組織）構(gòu)成。斑馬魚牙齒通過順序再生進(jìn)行終生更新，這一過程在機(jī)制上與某些哺乳動(dòng)物的雙套牙替換類似。這一獨(dú)特特性使其成為研究損傷后牙胚修復(fù)的有力模型。

分泌鈣結(jié)合磷蛋白（SCPP）基因家族在牙齒和骨骼組織的形成中起著關(guān)鍵作用。作為P/Q-rich SCPP基因家族的一員，scpp5在斑馬魚中表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞類型特異性，僅在成牙譜系（內(nèi)釉上皮和成牙本質(zhì)細(xì)胞）中表達(dá)，而在成骨細(xì)胞中檢測(cè)不到。

本研究利用了硝基還原酶（NTR）/甲硝唑（MTZ）系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過細(xì)胞類型特異性的NTR表達(dá)實(shí)現(xiàn)空間控制，并通過MTZ給藥實(shí)現(xiàn)時(shí)間調(diào)控。NTR介導(dǎo)的MTZ還原會(huì)產(chǎn)生DNA烷基化的硝基中間體，從而誘導(dǎo)靶向細(xì)胞死亡，同時(shí)保留鄰近的NTR陰性細(xì)胞群。利用這種形態(tài)學(xué)上的簡單性以及scpp5的成牙譜系特異性表達(dá)，我們采用NTR/MTZ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了牙胚細(xì)胞的時(shí)空消融，從而建立了一個(gè)精確的牙胚損傷模型。

視黃酸（RA）是視黃醇（維生素A）的合成或天然衍生物，對(duì)脊索動(dòng)物胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。它在局部發(fā)揮作用，通過細(xì)胞自主（自分泌）和非細(xì)胞自主（旁分泌）機(jī)制影響產(chǎn)生細(xì)胞本身或鄰近的靶細(xì)胞。雖然RA信號(hào)在牙發(fā)生中的作用已得到證實(shí)，但其在損傷牙胚修復(fù)過程中的作用仍不清楚。

研究使用了AB遺傳背景的斑馬魚作為野生型。為構(gòu)建pBluescript-scpp5:Dendra2-NTR質(zhì)粒，從斑馬魚基因組DNA中克隆了scpp5的4900-bp啟動(dòng)子，并亞克隆到pBluescript-Dendra2-NTR載體中。將該質(zhì)粒與I-SceI共同注射到AB背景胚胎的單細(xì)胞期以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。

利用MTZ處理建立了牙胚損傷模型。斑馬魚在受精后3天（3 dpf）用MTZ處理48小時(shí)。對(duì)于小分子處理，斑馬魚被培養(yǎng)在含有不同化合物（如RA、視黃醛、視黃醇、他拉羅唑或DEAB）的卵水中。使用熱休克條件誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因品系（如Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)和Tg(hsp70l:aldh1a2-p2a-mCherry; cryaa:venus)）中特定基因的表達(dá)。

研究采用了多種技術(shù)方法，包括原位雜交（ISH）以檢測(cè)基因表達(dá)模式，抗體染色以觀察Dendra2熒光蛋白的表達(dá)，熒光原位雜交（FISH）用于共定位分析，TUNEL染色以檢測(cè)細(xì)胞凋亡，茜素紅染色以觀察牙齒礦化情況，以及定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）來量化基因表達(dá)水平。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行。

首先通過原位雜交在5 dpf的斑馬魚中檢測(cè)了scpp5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其特異性表達(dá)在咽部牙胚區(qū)域。隨后成功構(gòu)建了scpp5:Dendra2-NTR重組質(zhì)粒并建立了轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。熒光共定位證實(shí)Dendra2陽性細(xì)胞確實(shí)是表達(dá)scpp5的細(xì)胞。對(duì)3至7 dpf的Tg(scpp5:Dendra2-NTR)斑馬魚牙胚發(fā)育的觀察顯示，4V1的熒光僅在3 dpf可檢測(cè)到，而3V1和5V1的熒光標(biāo)記從4 dpf開始可見，在6 dpf達(dá)到峰值，到7 dpf明顯減弱。茜素紅染色顯示了牙齒附著和更替的動(dòng)態(tài)過程。這些結(jié)果表明Tg(scpp5:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系已成功建立。

在成功建立轉(zhuǎn)基因品系后，測(cè)試了不同濃度的MTZ以誘導(dǎo)牙胚損傷。在MTZ濃度≥14 mM時(shí)，抗體染色顯示Dendra2標(biāo)記的牙胚細(xì)胞被完全消除，且斑馬魚的存活不受影響。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，使用14 mM MTZ在3-5 dpf處理斑馬魚以建立牙胚損傷模型。TUNEL染色證實(shí)NTR表達(dá)的牙胚細(xì)胞經(jīng)歷了凋亡性細(xì)胞死亡。

通過抗體染色和茜素紅染色監(jiān)測(cè)了從修復(fù)0天到修復(fù)3天牙胚的修復(fù)過程。在MTZ組，修復(fù)3V和5V在修復(fù)2天時(shí)附著到角鰓骨上，熒光在修復(fù)1天到1.5天達(dá)到峰值，之后下降。在DMSO對(duì)照組中，3V1/5V1的附著發(fā)生得更早。此外，MTZ組中4V2的出現(xiàn)晚于DMSO組。對(duì)斑馬魚牙胚標(biāo)記物fth1b和cx43的ISH分析顯示，在MTZ處理組中，兩者的表達(dá)域從修復(fù)0天到修復(fù)1天逐漸擴(kuò)大。FISH分析進(jìn)一步揭示，在MTZ組中，與牙齒礦化相關(guān)的基因ambn和enam的表達(dá)在修復(fù)0天到修復(fù)1天期間逐漸增加，而在DMSO組中，這些基因的表達(dá)在修復(fù)1天時(shí)下降。綜上所述，研究結(jié)果確立了Tg(scpp5:Dendra2-NTR)斑馬魚作為通過NTR/MTZ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)靶向細(xì)胞消融的牙胚損傷模型。

細(xì)胞內(nèi)RA信號(hào)傳導(dǎo)的主要事件包括視黃醇轉(zhuǎn)化為視黃醛，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為RA。為了確定RA信號(hào)在損傷后牙胚修復(fù)中的功能參與，使用qPCR分析了斑馬魚角鰓區(qū)域RA信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)。在修復(fù)0天，qPCR分析表明MTZ處理顯著上調(diào)了18個(gè)類視黃醇通路基因，其中aldh1a2在所有RA信號(hào)基因中表現(xiàn)出最顯著的上調(diào)。ISH顯示，MTZ處理在修復(fù)0天和修復(fù)1天擴(kuò)大了aldh1a2的表達(dá)域。這些數(shù)據(jù)表明，MTZ誘導(dǎo)的損傷觸發(fā)了RA信號(hào)通路的激活。

研究發(fā)現(xiàn)，在沒有MTZ誘導(dǎo)損傷的情況下，外源性RA處理不會(huì)改變Dendra2熒光強(qiáng)度或牙齒礦化。相比之下，在MTZ消融后從修復(fù)0天到修復(fù)1天給藥，外源性RA顯著增加了損傷組在修復(fù)0.5天和修復(fù)1天的Dendra2熒光強(qiáng)度。此外，茜素紅染色顯示，與對(duì)照組相比，修復(fù)1天時(shí)修復(fù)3V和修復(fù)5V的修復(fù)進(jìn)程加快。在MTZ上調(diào)的18個(gè)類視黃醇通路基因中，qPCR分析顯示外源性RA處理顯著上調(diào)了其中8個(gè)基因，而另外10個(gè)基因未發(fā)生顯著變化。值得注意的是，外源性RA處理并未影響aldh1a2的表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究內(nèi)源性RA在牙胚修復(fù)中的作用，使用了他拉羅唑（TZ）處理斑馬魚，這是一種選擇性的CYP26A1/CYP26B1抑制劑，可阻止內(nèi)源性RA的降解。鑒于raraa對(duì)外源性RA的反應(yīng)表現(xiàn)出最強(qiáng)的上調(diào)，研究采用了顯性失活方法構(gòu)建了Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)轉(zhuǎn)基因品系，該品系利用hsp70l熱休克啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的顯性失活RARAA突變來破壞RA下游信號(hào)傳導(dǎo)。抗體染色和茜素紅染色顯示，Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)轉(zhuǎn)基因品系損害了牙胚損傷后的修復(fù)過程，而TZ則促進(jìn)了該過程。

然而，外源性添加RA前體物質(zhì)（視黃醇或視黃醛）對(duì)損傷后的牙胚修復(fù)過程沒有影響。qPCR基因表達(dá)分析表明，外源性視黃醇增強(qiáng)了rbp4的表達(dá)，而視黃醛上調(diào)了6個(gè)基因。值得注意的是，視黃醇和視黃醛均不影響aldh1a2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，RA在調(diào)節(jié)損傷后牙胚修復(fù)方面具有獨(dú)特的功能，而不是其前體視黃醇或視黃醛，并且aldh1a2在此過程中成為RA信號(hào)通路中的關(guān)鍵介質(zhì)。

為了研究aldh1a2在損傷后牙胚修復(fù)中的功能作用，我們結(jié)合了藥理學(xué)抑制（使用特異性醛脫氫酶抑制劑DEAB）和遺傳過表達(dá)（使用轉(zhuǎn)基因品系Tg(hsp70l:aldh1a2-p2a-mCherry; cryaa:venus)）兩種方法。DEAB處理降低了aldh1a2的表達(dá)，而過表達(dá)aldh1a2則增加了其表達(dá)。

抗體染色顯示，DEAB顯著降低了修復(fù)0.5天和修復(fù)1天的Dendra2熒光強(qiáng)度，而aldh1a2過表達(dá)則增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度。茜素紅染色表明，DEAB損害了牙胚修復(fù)，而aldh1a2過表達(dá)促進(jìn)了修復(fù)1天時(shí)的牙胚修復(fù)。TUNEL染色揭示了對(duì)細(xì)胞凋亡的相反影響：DEAB增加了牙胚中凋亡細(xì)胞的數(shù)量，而aldh1a2過表達(dá)則減少了修復(fù)0.5天和修復(fù)1天時(shí)牙胚中的凋亡細(xì)胞。類似地，ISH分析顯示，DEAB下調(diào)了cx43和fth1b的表達(dá)，而aldh1a2過表達(dá)則上調(diào)了它們?cè)谛迯?fù)0.5天和修復(fù)1天的表達(dá)。與這些觀察結(jié)果一致，qPCR分析表明，DEAB抑制了參與牙胚細(xì)胞分化和礦化的基因的表達(dá)，而aldh1a2過表達(dá)則增強(qiáng)了這些基因的表達(dá)。綜上所述，這些結(jié)果表明aldh1a2活性調(diào)節(jié)損傷后牙胚修復(fù)的進(jìn)程。

本研究證實(shí)，RA信號(hào)在介導(dǎo)斑馬魚NTR/MTZ誘導(dǎo)損傷后的牙胚修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。具體而言，MTZ處理后，在修復(fù)0天觀察到4V1礦化受損，而3V1和5V1牙齒缺失。這種表型模式可以通過scpp5在4V1中的表達(dá)早于3V1和5V1來解釋。

盡管視黃醇、視黃醛和RA是維生素A途徑中的連續(xù)代謝物，但它們對(duì)斑馬魚牙胚修復(fù)的影響存在顯著差異。雖然外源性RA促進(jìn)修復(fù)，但視黃醇和視黃醛沒有這種活性。這種功能差異與其他再生模型中的發(fā)現(xiàn)一致。

RA信號(hào)已被證明不僅在調(diào)控組織和器官發(fā)育中起關(guān)鍵作用，而且在促進(jìn)特定組織的修復(fù)和再生過程中也至關(guān)重要。在哺乳動(dòng)物中，RA水平的過量或不足都會(huì)導(dǎo)致牙齒發(fā)育的嚴(yán)重異常。然而，在斑馬魚牙齒發(fā)育過程中調(diào)節(jié)RA信號(hào)對(duì)牙齒數(shù)量模式產(chǎn)生了顯著影響。在損傷后的牙齒修復(fù)或再生中，干細(xì)胞的重分化對(duì)于保持成牙潛能至關(guān)重要。先前的研究已經(jīng)證實(shí)RA是早期外胚層誘導(dǎo)劑，可以在體外指導(dǎo)多能干細(xì)胞向牙上皮譜系分化。此外，RA補(bǔ)充增強(qiáng)了成牙基因的表達(dá)，并促進(jìn)了培養(yǎng)的小鼠牙間充質(zhì)細(xì)胞的成牙能力。我們的研究結(jié)果表明，RA處理促進(jìn)了斑馬魚修復(fù)3V和修復(fù)5V牙胚的修復(fù)。這種效應(yīng)可能歸因于RA增強(qiáng)了常駐上皮和間充質(zhì)干細(xì)胞的重分化，或源自3V2和5V2的牙胚細(xì)胞的過早發(fā)育。RA信號(hào)的復(fù)雜性反映在其情境依賴性角色上，這在發(fā)育、損傷修復(fù)和不同物種間的差異中得到了證明。

在本研究中，靶向細(xì)胞消融是通過NTR/MTZ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，其中NTR陽性牙胚細(xì)胞將MTZ轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性化合物，選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在斑馬魚隨后的修復(fù)階段，這些細(xì)胞中的凋亡受到視黃酸信號(hào)通路的調(diào)節(jié)——該通路因其在再生過程中平衡細(xì)胞凋亡和組織重塑的關(guān)鍵作用而得到認(rèn)可。RA的一個(gè)關(guān)鍵特征是其情境依賴性，在細(xì)胞凋亡中扮演雙重角色，能夠根據(jù)細(xì)胞類型、類視黃醇種類和共存的信號(hào)線索等變量促進(jìn)或抑制細(xì)胞死亡。在各種癌癥中，RA激活會(huì)導(dǎo)致生長停滯和凋亡。相反，在損傷后的組織修復(fù)和再生中，RA通常表現(xiàn)出抗凋亡功能。例如，在急性腎損傷模型中，RA給藥減少了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。類似地，在成年斑馬魚鰭再生過程中，持續(xù)的RA信號(hào)通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2來增強(qiáng)增殖性胚基細(xì)胞的存活。RA的保護(hù)作用也在上皮和內(nèi)皮環(huán)境中被觀察到。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們的研究進(jìn)一步支持RA信號(hào)在損傷后牙胚修復(fù)過程中對(duì)細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控作用。然而，RA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控的確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

總之，這項(xiàng)工作證明了RA信號(hào)在損傷牙胚修復(fù)中的關(guān)鍵作用。我們的研究通過建立Tg(scpp5:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以及利用MTZ/NTR系統(tǒng)開發(fā)靶向斑馬魚牙胚損傷模型支持了這一假設(shè)。利用該模型，我們觀察到RA信號(hào)調(diào)節(jié)牙胚修復(fù)。然而，RA信號(hào)與其他通路之間的相互作用，以及其對(duì)上皮-間充質(zhì)相互作用的影響仍不清楚，值得進(jìn)一步研究。總之，我們的研究結(jié)果為促進(jìn)損傷后牙胚修復(fù)提供了新的見解。