在細(xì)胞表面的信號傳導(dǎo)與通訊網(wǎng)絡(luò)中，有一類被稱為解整合素金屬蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase, ADAM）的“剪刀手”，它們負(fù)責(zé)切割（或稱“脫落”）膜蛋白的胞外域，從而釋放或激活關(guān)鍵信號分子，影響細(xì)胞的命運(yùn)。ADAM9便是其中一把重要的“剪刀”，它的功能失調(diào)與多種嚴(yán)重疾病緊密相關(guān)：從促進(jìn)實(shí)體瘤的生長與擴(kuò)散，到加劇慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）和自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，甚至在年輕重癥COVID-19患者體內(nèi)，ADAM9的表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)，可能助長了病毒的感染與復(fù)制。然而，盡管其在病理過程中的重要性日益凸顯，這把“剪刀”究竟在細(xì)胞表面剪斷了哪些蛋白（即其底物），以及這些剪切事件最終觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的哪些信號通路，很大程度上仍是一個“黑箱”。這種未知不僅限制了我們深入理解ADAM9驅(qū)動疾病的分子機(jī)制，也給將其作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)帶來了潛在風(fēng)險(xiǎn)——因?yàn)槲覀儾磺宄�抑制它可能會意外影響到哪些正常的生理過程。

傳統(tǒng)上，科學(xué)家們主要通過分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)（即分泌蛋白質(zhì)組學(xué)，secretomics）來尋找這類蛋白酶的底物。但這種方法存在明顯局限：一些被切割下來的蛋白片段可能并未被釋放到細(xì)胞外，而是仍然附著在膜上或很快被降解；同時，上清液中蛋白質(zhì)豐度的變化也可能源于轉(zhuǎn)錄水平的改變，而非直接的蛋白水解事件，這導(dǎo)致了假陰性和假陽性結(jié)果的困擾。此外，分泌蛋白質(zhì)組學(xué)難以揭示底物被切割后所引發(fā)的下游基因和通路變化。為了突破這些瓶頸，一篇發(fā)表在《Molecular 》上的研究另辟蹊徑，開發(fā)了一種全新的、非偏向性的整合蛋白質(zhì)組-轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，系統(tǒng)性地描繪了ADAM9的“工作圖譜”。

研究人員為開展這項(xiàng)研究，主要運(yùn)用了以下幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，他們選擇具有穩(wěn)定二倍體核型、適合組學(xué)分析的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系，通過小干擾RNA（siRNA）技術(shù)敲低ADAM9的表達(dá)。隨后，他們對對照組和ADAM9敲低組細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）和基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（Tandem Mass Tag, TMT）標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。最后，他們采用雙向正交偏最小二乘法（O₂PLS）對轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，以區(qū)分受ADAM9轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的靶蛋白，并從后者中篩選出潛在的細(xì)胞表面底物。

研究人員成功敲低了HCT116細(xì)胞中的ADAM9，并進(jìn)行了RNA-seq和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，分別檢測到12,519個mRNA和6,645個蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)分析顯示，ADAM9敲低樣本與對照組在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上均能清晰區(qū)分。通過整合兩組數(shù)據(jù)并利用O₂PLS分析，他們系統(tǒng)鑒定出了受ADAM9轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，為后續(xù)篩選底物和解析下游通路奠定了基礎(chǔ)。

通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ADAM9敲低顯著影響了多個與Akt激酶相關(guān)的通路，包括PI3K-Akt、mTOR和FOXO信號通路。進(jìn)一步分析證實(shí)，ADAM9敲低后，蛋白質(zhì)水平的FOXO3顯著上調(diào)，而其mRNA水平未變，表明這是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，ADAM9敲低導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)FOXO3水平增加。同時，已知的FOXO3靶基因（如MUC13、THBS1和GDA）的mRNA表達(dá)也隨ADAM9敲低而上調(diào)。這些結(jié)果表明，ADAM9在HCT116細(xì)胞中抑制了腫瘤抑制通路FOXO信號。結(jié)合已發(fā)表的研究（該團(tuán)隊(duì)此前工作），ADAM9也促進(jìn)致癌的mTOR信號通路。因此，ADAM9通過同時激活mTOR和抑制FOXO信號，協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

基于“ADAM9敲低后，其底物應(yīng)在細(xì)胞膜上積累”的假設(shè)，研究人員從與ADAM9負(fù)相關(guān)且受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，篩選出64個定位于細(xì)胞表面的膜蛋白作為ADAM9的潛在底物候選者。這些蛋白包括35個單次跨膜蛋白、26個多次跨膜蛋白和2個糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白。

研究人員從中選擇了ALCAM、IGSF8和IL10RB進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)表明，敲低ADAM9會減少培養(yǎng)基中脫落的ALCAM胞外域，同時增加細(xì)胞裂解物中的全長ALCAM蛋白；而過表達(dá)野生型ADAM9（而非其蛋白酶失活突變體E348A）則能增強(qiáng)ALCAM的脫落。即使在ADAM17基因敲除的細(xì)胞中，野生型ADAM9仍能促進(jìn)ALCAM脫落，證明該過程不依賴于ADAM17。因此，ALCAM是ADAM9的直接底物。對于IGSF8，敲低ADAM9抑制了其脫落，但過表達(dá)野生型和突變型ADAM9都能促進(jìn)其脫落，這表明IGSF8可能是ADAM9的間接底物。對于IL10RB，敲低ADAM9會上調(diào)其全長蛋白水平。雖然在其培養(yǎng)基中未檢測到脫落的胞外域，但在過表達(dá)野生型ADAM9（而非E348A突變體）的細(xì)胞裂解物中發(fā)現(xiàn)了該片段，提示IL10RB被切割后，其胞外域可能仍滯留在細(xì)胞表面或發(fā)生內(nèi)化。這些結(jié)果驗(yàn)證了ALCAM、IGSF8和IL10RB是ADAM9的新底物。

本研究成功開發(fā)并應(yīng)用了一種整合蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的新方法，系統(tǒng)性地揭示了ADAM9的下游信號網(wǎng)絡(luò)和底物譜。研究不僅證實(shí)了ADAM9通過調(diào)節(jié)致癌的mTOR通路和抑癌的FOXO通路影響細(xì)胞命運(yùn)，更重要的是，鑒定出了三個新的ADAM9相關(guān)底物：ALCAM、IGSF8和IL10RB。這些發(fā)現(xiàn)具有多重重要意義：首先，新發(fā)現(xiàn)的底物在疾病中扮演關(guān)鍵角色，例如ALCAM和IGSF8與實(shí)體瘤進(jìn)展相關(guān)，IL10RB則在COPD、COVID-19和自身免疫疾病中上調(diào)，這為理解ADAM9在多種疾病中的具體作用機(jī)制提供了直接線索。其次，研究驗(yàn)證了該方法能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)分泌蛋白質(zhì)組學(xué)可能遺漏的底物（如IL10RB），證明了整合多組學(xué)策略在底物篩選中的優(yōu)越性和必要性。最后，該研究為ADAM9作為癌癥、炎癥性疾病等的潛在治療靶點(diǎn)提供了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和更豐富的干預(yù)視角，同時提示在靶向ADAM9進(jìn)行治療時，需考慮其對FOXO等抑癌通路的影響，以全面評估療效與安全性。這項(xiàng)工作不僅增進(jìn)了對ADAM9生物學(xué)功能的理解，也為研究其他膜蛋白酶提供了一套可借鑒的高通量、系統(tǒng)性研究框架。