《Neurobiology of Disease》：Prenatal caloric restriction reprograms endothelial transcriptional states and blood-brain barrier integrity: Implications for neurodevelopmental disorders
編輯推薦：
為解決早期營養(yǎng)壓力如何編程大腦血管并影響成年后精神疾病風(fēng)險的問題，研究人員開展了一項(xiàng)探究產(chǎn)前熱量限制（RP）作為發(fā)育“第一擊”及成年熱量限制（CR）作為“第二擊”對小鼠腦內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄狀態(tài)影響的研究。他們發(fā)現(xiàn)RP誘導(dǎo)了顯著的血管轉(zhuǎn)錄重編程，塑造了內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)，并改變了對成年期CR的適應(yīng)性反應(yīng)，提示早期營養(yǎng)壓力可能通過損害神經(jīng)血管完整性，建立對精神疾病（如精神分裂癥）的易感性。
懷孕期間的營養(yǎng)狀況對后代的長期健康有著深遠(yuǎn)的影響，這已經(jīng)不是什么秘密。然而，其背后具體如何編程（programming）胎兒的大腦發(fā)育，特別是如何影響那些保護(hù)大腦、控制物質(zhì)進(jìn)出的關(guān)鍵“守門員”——血腦屏障（Blood-Brain Barrier, BBB），仍然是一個有待深入探索的謎團(tuán)。大量的流行病學(xué)證據(jù)，如歷史上的“荷蘭饑荒冬天”和“中國大饑荒”，都指向一個令人擔(dān)憂的關(guān)聯(lián)：母親在孕期經(jīng)歷的嚴(yán)重營養(yǎng)不良，其后代在成年后罹患精神分裂癥等精神疾病的風(fēng)險顯著增高。這背后的生物學(xué)機(jī)制是什么？早期的營養(yǎng)壓力是否在胎兒大腦的血管系統(tǒng)上留下了不可磨滅的“印記”，從而為未來的神經(jīng)精神障礙埋下了伏筆？
為了回答這些問題，一項(xiàng)發(fā)表在《Neurobiology of Disease》上的研究進(jìn)行了一次深入的探索。研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)，產(chǎn)前的熱量限制（Prenatal caloric restriction, RP）就像一次發(fā)育中的“第一擊”，它會重塑大腦內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序（即基因表達(dá)模式）。而當(dāng)個體在成年后再次遭遇營養(yǎng)壓力（如熱量限制，Caloric restriction, CR）時，這個預(yù)先被編程過的系統(tǒng)會做出不同于正常狀態(tài)的反應(yīng)，這構(gòu)成了“第二擊”。這種“雙重打擊”模型可能解釋了為何早期逆境會增加個體對后期應(yīng)激的脆弱性。
為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員設(shè)計了一個精巧的小鼠實(shí)驗(yàn)。他們讓孕鼠在特定時期接受熱量限制（RP，攝入量為正常量的70%），產(chǎn)下雄性后代。這些后代在成年后，一部分接受正常的隨意飲食（ad libitum, AL），另一部分則再次接受成年期的熱量限制（CR）。這樣就形成了四個實(shí)驗(yàn)組：一直正常飲食的對照組（AL–AL）、僅成年期限制組（AL–CR）、僅產(chǎn)前限制組（RP–AL）以及產(chǎn)前和成年期均受限制的“雙重打擊”組（RP–CR）。通過對這些成年小鼠的全腦進(jìn)行RNA測序（RNA-seq），并結(jié)合先進(jìn)的生物信息學(xué)分析，研究團(tuán)隊(duì)得以窺探不同營養(yǎng)經(jīng)歷下大腦的全局基因表達(dá)譜和特定細(xì)胞類型的變化。
研究主要運(yùn)用了以下幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，通過RNA測序獲取全腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。其次，利用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)庫作為參考，通過MuSiC反卷積（deconvolution）方法從批量RNA-seq數(shù)據(jù)中估算不同細(xì)胞類型（特別是內(nèi)皮細(xì)胞亞型）的比例。第三，采用基因集變異分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）來評估與血管生成、血腦屏障完整性等相關(guān)生物學(xué)通路的活性變化。研究對象為BALB/c品系小鼠，所有分析均基于從這些小鼠腦中提取的RNA。
3.1. 產(chǎn)前飲食驅(qū)動成年大腦中持續(xù)的轉(zhuǎn)錄差異
通過主成分分析（PCA）和UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，根據(jù)成年期飲食（AL或CR），樣本的轉(zhuǎn)錄組譜出現(xiàn)了第一層級的區(qū)分。更重要的是，在同樣經(jīng)歷成年期CR的情況下，產(chǎn)前經(jīng)歷正常飲食（AL-CR）和產(chǎn)前經(jīng)歷限制（RP-CR）的樣本也出現(xiàn)了分離。這表明產(chǎn)前熱量限制（RP）本身就能塑造成年后的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)，其影響具有持久性。
3.2. 全腦RNA-seq反卷積揭示產(chǎn)前限制誘導(dǎo)內(nèi)皮尖端-柄細(xì)胞失衡
為了探究BBB功能失調(diào)的假設(shè)，研究團(tuán)隊(duì)對批量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了反卷積分析，以估算不同細(xì)胞類型的比例。結(jié)果顯示，在所有實(shí)驗(yàn)組中，神經(jīng)元都是最主要的細(xì)胞類型。然而，在內(nèi)皮細(xì)胞亞型中，發(fā)現(xiàn)了顯著變化：“雙重打擊”組（RP–CR）中，具有促血管生成特征的內(nèi)皮尖端細(xì)胞（endothelial tip cells）的轉(zhuǎn)錄特征比例顯著增加，而負(fù)責(zé)血管穩(wěn)定性的內(nèi)皮柄細(xì)胞（endothelial stalk cells）的特征比例則顯著降低甚至幾乎消失。統(tǒng)計分析表明，母體飲食（即產(chǎn)前RP）對這兩種內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)的比例都有顯著的主效應(yīng)。這提示RP可能導(dǎo)致大腦血管向一種更偏向于生長、遷移但可能穩(wěn)定性較差的狀態(tài)傾斜。
3.3. 基于標(biāo)記物的分析證實(shí)母體限制導(dǎo)致的血管重編程
為了進(jìn)一步驗(yàn)證，研究使用了Cell Markers 2.0數(shù)據(jù)庫中的細(xì)胞類型特異性基因標(biāo)記進(jìn)行GSVA分析。結(jié)果同樣顯示，母體飲食（RP）顯著影響了內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的基因集富集分?jǐn)?shù)，其中對內(nèi)皮細(xì)胞的影響尤為突出。這從另一個角度證實(shí)了早期營養(yǎng)壓力對血管細(xì)胞，特別是構(gòu)成BBB核心的內(nèi)皮細(xì)胞，具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄重編程能力。
3.4. GSVA揭示產(chǎn)前限制激活血管生成并抑制VEGF通路
接下來，研究人員聚焦于血管相關(guān)的生物學(xué)過程。GSVA分析發(fā)現(xiàn)，與“發(fā)芽血管生成中細(xì)胞遷移的正調(diào)控”相關(guān)的通路在RP-CR組中活性最高。然而，令人意外的是，與血管穩(wěn)定密切相關(guān)的“血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）信號通路”的活性卻在RP-CR組中最低。同時，“血管相關(guān)平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控”通路活性也呈下降趨勢。這表明RP誘導(dǎo)的血管狀態(tài)是矛盾的：一方面促血管生成的程序被激活，另一方面那些促進(jìn)血管成熟、穩(wěn)定的關(guān)鍵信號（如VEGF通路）卻被抑制。這種不平衡可能導(dǎo)致形成的血管網(wǎng)絡(luò)雖然“樂于”生長，卻結(jié)構(gòu)松散、通透性增加，從而損害BBB的完整性。
為了找出驅(qū)動這些通路變化的關(guān)鍵基因，研究人員進(jìn)行了相關(guān)性分析。他們鎖定了三個與血管生成通路分?jǐn)?shù)高度相關(guān)且受飲食條件顯著調(diào)控的基因：
- •
Kdr：即VEGFR2（VEGF受體2），是主要的促血管生成受體。研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在RP-CR組中下調(diào)，且與促發(fā)芽通路分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。這意味著在“雙重打擊”下，盡管促血管生成程序活躍，但關(guān)鍵的VEGF信號接收能力卻減弱，可能是一種適應(yīng)不良的表現(xiàn)。
- •
Hdac7：組蛋白去乙酰化酶7，參與內(nèi)皮細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控和穩(wěn)定性維持。其表達(dá)在RP-CR組中下調(diào)，且與促遷移通路分?jǐn)?shù)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。Hdac7的減少可能意味著維持內(nèi)皮細(xì)胞靜止和屏障功能的“剎車”機(jī)制被解除。
- •
Mmrn2：多聚體蛋白2，是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，能抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。其表達(dá)與抑制內(nèi)皮遷移的通路分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，在對照組中較高，而在RP組中較低。Mmrn2的減少可能解除對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制，加劇血管的不穩(wěn)定。
這些基因的表達(dá)變化通過qPCR得到了部分驗(yàn)證，尤其Kdr的結(jié)果非常一致。
3.5. 母體體重增加與血管穩(wěn)定通路呈負(fù)相關(guān)
有趣的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)，懷孕期間母鼠的體重增加量與后代大腦中多個血管穩(wěn)定相關(guān)通路（如VEGF信號通路、平滑肌細(xì)胞分化）的GSVA分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。這意味著，在實(shí)驗(yàn)條件下，母體孕期體重增加越少（可能反映營養(yǎng)壓力越大），后代成年后大腦血管的穩(wěn)定相關(guān)基因程序活性反而越低，進(jìn)一步將母體營養(yǎng)狀態(tài)與后代的長期血管編程聯(lián)系起來。
綜合以上結(jié)果，研究得出了明確的結(jié)論。產(chǎn)前熱量限制能夠在發(fā)育早期對大腦內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行持久性的轉(zhuǎn)錄重編程，使其傾向于一種促血管生成但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)這些個體在成年后再次遭遇營養(yǎng)壓力時，其血管系統(tǒng)無法做出正常的適應(yīng)性反應(yīng)，反而表現(xiàn)出一種適應(yīng)不良的可塑性改變。 這種早期編程效應(yīng)由Kdr、Hdac7和Mmrn2等關(guān)鍵基因的失調(diào)所介導(dǎo)，它們共同整合了促血管生成信號、內(nèi)皮細(xì)胞身份的表觀遺傳控制和細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的血管穩(wěn)定作用。
在討論中，作者將這一發(fā)現(xiàn)置于“健康與疾病發(fā)育起源（Developmental Origins of Health and Disease, DOHaD）”假說的框架下，首次將產(chǎn)前營養(yǎng)對大腦血管生物學(xué)的長期編程作用提升到機(jī)制層面。他們認(rèn)為，這種由早期營養(yǎng)壓力建立的神經(jīng)血管脆弱性，可能是連接產(chǎn)前營養(yǎng)不良與成年后精神分裂癥等神經(jīng)精神疾病風(fēng)險增加的潛在機(jī)制鏈條。BBB完整性的早期損害可能導(dǎo)致神經(jīng)炎癥風(fēng)險增加、神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，從而為精神疾病的發(fā)生創(chuàng)造條件。盡管本研究是相關(guān)性的，但它為理解早期環(huán)境如何塑造終身大腦健康提供了全新的血管視角，強(qiáng)調(diào)了孕產(chǎn)婦營養(yǎng)作為可調(diào)控因素的重要性，并指出了針對神經(jīng)血管系統(tǒng)進(jìn)行早期干預(yù)以預(yù)防精神疾病的潛在時間窗口和治療靶點(diǎn)。
