番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內重要的經濟作物，但常受到病毒病害的嚴重威脅，其中番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是造成番茄黃化曲葉病的主要病原，可導致產量和品質的巨大損失。TYLCV屬于菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus），通過煙粉虱（Bemisia tabaci）以持久循環方式高效傳播，其基因組編碼多個蛋白，其中V2蛋白被鑒定為一種RNA沉默抑制因子（RSS），能夠通過結合雙鏈小干擾RNA（ds siRNA）等方式，干擾宿主的轉錄和轉錄后基因沉默，從而抑制植物的抗病毒RNA干擾（RNAi）機制。

植物擁有一套復雜的防御系統來對抗病原體入侵。轉錄因子（TFs）在調控防御基因表達中起著核心作用。APETALA2/乙烯響應因子（AP2/ERF）超家族是一個龐大的植物特異性轉錄因子家族，其中RAV（RELATED TO ABSCISIC ACID INSENSITIVE3/VIVIPAROUS2）亞家族成員包含AP2和B3兩個DNA結合域。越來越多的證據表明，RAV轉錄因子參與了植物對多種生物脅迫的響應，尤其是在水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）介導的防御反應中發揮作用。例如，葡萄中的VvRAV1可與病毒蛋白互作調控防御基因VvPR1的表達，而梨中的PbRAV1通過互作增強了對蘋果莖溝病毒的抵抗。然而，番茄中RAV家族成員在抗病毒，特別是抗TYLCV感染中的具體功能和分子機制尚不清楚。

本研究基于前期發現TYLCV感染后番茄中一個RAV基因（SlRAV2）表達顯著上調，深入探究了SlRAV2在TYLCV感染中的作用。通過酵母雙雜交篩選，發現SlRAV2與TYLCV的V2蛋白存在直接相互作用，并圍繞這一互作展開了一系列分子和功能分析。

以TYLCV V2蛋白為誘餌進行酵母雙雜交篩選，從一個番茄cDNA文庫中鑒定出一個與SlRAV2 C端區域相互作用的克隆。進一步的實驗證實了SlRAV2全長與V2在酵母中的互作，并且這種互作依賴于SlRAV2的C端區域（包含B3結構域），而其N端區域（包含AP2結構域）則不參與互作。這一結果在體外下拉實驗和植物體內的雙分子熒光互補實驗中得到了驗證。

C互作產生的熒光信號，定位于細胞核。">

通過瞬時沉默和過表達SlRAV2基因，研究其對TYLCV積累的影響。結果表明，沉默SlRAV2會導致接種早期（2天）局部葉片中病毒積累減少，但到了后期（4天和10天），局部和系統葉片中的病毒積累均高于對照。相反，過表達SlRAV2則導致接種早期（2天）局部病毒積累短暫升高，隨后（4天）下降，并且在接種后10天，系統葉片中的病毒積累顯著低于對照。組織化學染色（臺盼藍和DAB染色）顯示，過表達SlRAV2減輕了系統葉片的壞死和活性氧積累，而沉默則加劇了這些癥狀。這些結果表明，SlRAV2通過促進局部葉片在感染早期的反應，限制了病毒向系統葉片的擴散。

SlRAV2增加番茄系統葉片TYLCV積累。C) 過表達SlRAV2減少番茄系統葉片TYLCV積累。B, D) 相應的DAB和臺盼藍染色結果顯示SlRAV2表達水平影響葉片壞死和活性氧積累程度。">

V2作為RSS，能抑制GFP報告基因的沉默。共表達實驗發現，當SlRAV2或其C端與V2共表達時，GFP的熒光強度和蛋白積累水平均顯著高于僅表達V2的對照，表明SlRAV2增強了V2的RSS活性。進一步的機制探究表明，V2能夠結合21-nt ds siRNA。電泳遷移率變動分析顯示，GST-SlRAV2或其C端蛋白的加入，顯著增強了V2-His與21-nt ds siRNA探針的結合能力。這些結果說明，SlRAV2通過蛋白質互作，增強了V2結合ds siRNA的能力，從而放大了其RSS功能。

SlPR1是SA防御通路的一個標志性基因。研究發現，過表達SlRAV2能上調SlPR1的表達。啟動子反式激活實驗表明，SlRAV2能直接激活SlPR1啟動子驅動的GUS報告基因表達。更重要的是，當V2與SlRAV2共表達時，GUS活性被進一步提升。EMSA實驗證實，SlRAV2能直接結合到SlPR1啟動子的一個保守‘CACCTG’基序上，并且V2的存在增強了SlRAV2與該DNA探針的結合。這表明，SlRAV2不僅自身能激活防御基因表達，還能利用與其互作的病毒蛋白V2來放大這一轉錄調控效應。

SlPR1基因的調控。A) SlRAV2過表達正調控SlPR1表達。B) SlRAV2激活SlPR1啟動子。C) V2與SlRAV2共表達進一步增強了啟動子活性。D) EMSA顯示V2增強了SlRAV2與SlPR1啟動子探針的結合。">

亞細胞定位分析顯示，SlRAV2單獨表達時定位于細胞核，而V2則同時定位于細胞核和細胞質。當兩者共表達時，SlRAV2的定位發生了變化，從單一的核定位轉變為核質共定位，而V2的定位模式不變。核質分離實驗的Western blot結果也證實了這一點。進一步的機制研究發現，SlRAV2能與核輸入受體Importin α互作，而V2的加入會在體外下拉實驗中削弱SlRAV2與Importin α的互作。這表明，V2通過與Importin α競爭性結合SlRAV2，干擾了SlRAV2的核輸入過程，導致其部分滯留于細胞質。

本研究揭示了一個由番茄轉錄因子SlRAV2與TYLCV V2蛋白互作所調控的、精妙且看似矛盾的抗病毒新機制。一方面，V2通過互作改變SlRAV2的亞細胞定位（使其部分進入細胞質），并招募SlRAV2來增強自身與21-nt ds siRNA的結合能力，從而放大了其RSS活性。這導致TYLCV在局部感染葉片中的積累出現短暫升高。另一方面，在細胞核內，V2卻出人意料地增強了SlRAV2對其靶基因SlPR1啟動子的結合與激活能力。

這種雙重調控的最終結果是，局部病毒積累的短暫激增和SlRAV2介導的防御基因（如SlPR1）的強力激活共同作用，引發了局部細胞活性氧的爆發和細胞壞死。這種快速而劇烈的局部超敏反應，如同一道“防火墻”，有效地將病毒限制在最初的感染部位，阻止了其向植株其他部分（系統葉片）的擴散。因此，雖然表面上看是病毒蛋白V2在“利用”宿主因子SlRAV2，但實質上SlRAV2巧妙地“反利用”了這一互作，激活了更強的防御反應來遏制病毒。

SlPR1啟動子的調控，最終通過激發局部防御反應抑制TYLCV的系統感染。">

這一發現不僅增進了我們對植物如何利用轉錄因子與病毒蛋白的“博弈”來實施抗病毒防御的理解，也為未來通過操控SlRAV2或其相關通路來培育抗TYLCV的番茄品種提供了新的潛在靶點和策略。該研究凸顯了宿主與病原體在共進化過程中形成的復雜而動態的相互作用網絡。