《Exploration》：Rumen Mycobiome Thiamine Metabolism Contributes to Subacute Rumen Acidosis Tolerance in Goats Through Enhancing Epithelial Cell Proliferation via IGFBP2/IGF1 Axis Activation
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本研究首次系統揭示了瘤胃真菌在亞急性瘤胃酸中毒（SARA）耐受性中的關鍵作用。通過多組學分析發現，耐受型山羊瘤胃中家蠶曲霉（Aspergillus bombycis） 的富集增強了硫胺素（維生素B1）代謝，進而下調瘤胃上皮miRNA chi-miR-17-26080，解除其對胰島素樣生長因子結合蛋白2（IGFBP2）的抑制。上調的IGFBP2促進IGF1募集，激活PI3K/AKT和ERK信號通路，驅動上皮基底層和棘層細胞增殖，從而增強揮發性脂肪酸（VFAs）吸收能力，維持瘤胃pH穩定，最終提升山羊對高精料飲食誘導的SARA的耐受性。這為通過靶向瘤胃真菌代謝干預反芻動物代謝疾病提供了新思路。
文章內容歸納總結：
引言
亞急性瘤胃酸中毒（Subacute Rumen Acidosis, SARA）是反芻動物常見的代謝性疾病，主要表現為瘤胃pH值持續偏低（低于5.6或5.8超過180分鐘/天），主要由高精料日糧發酵產生的揮發性脂肪酸（Volatile Fatty Acids, VFAs）在瘤胃內積累所引發。SARA會破壞瘤胃上皮屏障，誘發上皮炎癥，嚴重影響產奶量和動物健康。盡管個體對SARA的易感性存在差異，但其背后的微生物機制，尤其是除細菌外的瘤胃真菌（真菌組）的作用，尚不明確。瘤胃上皮是吸收VFAs、維持瘤胃內環境穩定的關鍵部位，其細胞亞型（如基底層細胞、棘層細胞、顆粒層細胞）的構成和功能變化可能與SARA耐受性相關。微生物與宿主之間的互作常通過微小RNA（miRNA）調控基因表達來實現。因此，本研究旨在通過整合瘤胃微生物組（尤其是真菌組）、瘤胃上皮單細胞轉錄組、轉錄組和miRNA組測序數據，揭示瘤胃真菌代謝功能如何通過調控上皮miRNA表達，影響上皮細胞亞型，進而決定山羊對SARA耐受性的分子機制。
結果
1. SARA的發生與瘤胃上皮炎癥
通過監測高精料飼喂后瘤胃pH動態變化，研究成功構建了SARA易感（HCS）和SARA耐受（HCT）山羊模型。與對照組（CON）和HCT組相比，HCS組山羊血漿中促炎因子TNF-α和IL-17濃度顯著升高，而抗炎因子IL-10濃度降低。瘤胃上皮轉錄組分析顯示，HCS組山羊上調的基因顯著富集在NF-κB、IL-17、TNF和Toll樣受體等炎癥與免疫反應相關信號通路，表明SARA發生伴隨著顯著的瘤胃上皮炎癥。
2. HCT山羊維持正常的瘤胃上皮狀態與VFAs吸收能力
與HCS組不同，HCT組山羊瘤胃上皮基因上調主要富集在細胞增殖、能量代謝相關通路。盡管瘤胃液VFAs濃度無顯著差異，但HCT組山羊血漿中總VFAs和丙酸比例顯著高于HCS組，而乙酸/丙酸比值更低，提示其VFAs吸收能力更強。組織學觀察發現，HCT組山羊瘤胃上皮乳頭更寬，角質層完整，細胞層次清晰，而上皮結構在HCS組山羊中出現損壞。
3. 上皮細胞在HCT山羊中增加，而免疫細胞在HCS山羊中增加
瘤胃上皮單細胞核RNA測序（snRNA-seq）分析揭示了上皮細胞、內皮細胞、T細胞、巨噬細胞等多種細胞類型。HCS組山羊上皮細胞比例降低，而CD4+T細胞和巨噬細胞比例升高。相反，HCT組山羊上皮細胞比例更高。對上皮細胞進行亞群細分，發現HCT組山羊的基底層細胞和棘層細胞數量增加，而HCS組山羊的顆粒層細胞增多�；讓雍图瑢蛹毎弑磉_VFAs吸收相關基因（如SLC16A1、SLC4A9）。基因集評分顯示，與VFAs吸收相關的基因在HCT組山羊的棘層細胞中表達更高。
4. 瘤胃真菌物種與功能的差異
瘤胃微生物組測序發現，真菌約占瘤胃微生物的1.71%。HCT組山羊瘤胃真菌的相對豐度高于HCS和CON組。在物種組成上，HCS和HCT組山羊中一些典型的厭氧真菌（如Orpinomyces sp. UKK1, Piromyces sp.）的豐度均低于CON組。然而，與CON和HCS組相比，HCT組山羊瘤胃中家蠶曲霉（Aspergillus bombycis） 和Podospora comata的豐度顯著增加。功能分析表明，HCS組山羊瘤胃真菌的碳水化合物和氨基酸代謝功能減弱，而HCT組山羊瘤胃真菌的硫胺素（thiamine）代謝功能顯著增強。
5. 家蠶曲霉與硫胺素代謝的關鍵作用
進一步分析發現，HCT組山羊瘤胃真菌中硫胺素代謝通路的富集與家蠶曲霉的豐度增加密切相關。Spearman相關性分析顯示，家蠶曲霉的豐度與血漿硫胺素含量呈顯著正相關。對家蠶曲霉單菌株基因組的分析證實，其基因組中包含完整的硫胺素合成途徑相關基因（如NFS1），具備從頭合成硫胺素的能力。此外，HCT組山羊瘤胃真菌的碳水化合物活性酶（CAZy）中，纖維素降解酶GH9模塊增加。
6. miRNA介導的基因表達調控
瘤胃上皮miRNA測序發現，與CON和HCS組相比，HCT組山羊有多條miRNA表達下調。這些下調miRNA的預測靶基因顯著富集在細胞增殖（如PI3K-Akt、Hippo、MAPK信號通路）、細胞連接（如黏著斑、緊密連接）和代謝相關通路。miRNA-mRNA關聯分析篩選出在HCT組中表達呈負相關的調控對。
7. 多組學關聯揭示真菌-miRNA-宿主基因調控軸
Spearman相關性分析將瘤胃真菌、miRNA和上皮基因表達聯系起來。家蠶曲霉的豐度與多個miRNA（如chi-miR-17-26080）呈負相關，而這些miRNA在HCT組中表達下調。其中，chi-miR-17-26080的預測靶基因是胰島素樣生長因子結合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein 2, IGFBP2）。雙熒光素酶報告基因實驗證實，chi-miR-17-26080可直接靶向抑制IGFBP2的表達。在HCT組山羊中，隨著chi-miR-17-26080表達下調，IGFBP2的表達顯著上調。
8. 硫胺素飼喂驗證其緩解SARA及促進增殖的機制
為了驗證硫胺素的作用，研究在高精料日糧（HCD）中添加硫胺素（HCD-T組）進行飼喂實驗。結果發現，補充硫胺素顯著降低了瘤胃上皮中chi-miR-17-26080的表達，緩解了上皮炎癥因子（如IL-1β, IL-17）的上調，并促進了細胞周期蛋白Cyclin A2和CDK4的表達。更重要的是，HCD-T組山羊瘤胃上皮中IGFBP2和IGF1的蛋白表達水平顯著升高，并伴隨著蛋白激酶B（AKT）和細胞外信號調節激酶（ERK）的磷酸化水平增強，表明IGFBP2/IGF1-PI3K/AKT和IGFBP2/IGF1-ERK信號通路被激活。這些變化共同促進了瘤胃上皮細胞的增殖。
討論
本研究系統闡述了瘤胃真菌組，特別是家蠶曲霉，在反芻動物SARA耐受性中的新穎機制。高精料飲食下，耐受型山羊瘤胃富集了具有增強硫胺素代謝能力的家蠶曲霉。增加的硫胺素可能通過下調瘤胃上皮細胞中的chi-miR-17-26080，解除其對IGFBP2的轉錄抑制。高表達的IGFBP2通過募集并激活IGF1，進而啟動下游的PI3K/AKT和ERK信號通路，最終上調細胞周期蛋白，驅動瘤胃上皮基底層和棘層細胞的增殖。更多具有VFAs吸收功能的基底層和棘層細胞增強了瘤胃對VFAs的吸收效率，減少了VFAs在瘤胃中的累積，從而有助于維持瘤胃pH穩定，避免SARA的發生。這突破了以往SARA研究主要關注細菌組的局限，首次揭示了真菌代謝物硫胺素通過一條清晰的miRNA-IGFBP2/IGF1信號軸調控上皮穩態和宿主代謝表型的完整途徑，為通過營養干預（如補充硫胺素）或微生物調控（如益生真菌）預防和治療反芻動物SARA提供了重要的理論依據和潛在靶點。
實驗方法
研究包括動物實驗模型構建（CON、HCS、HCT組及硫胺素添加組）、瘤胃液與血液樣本采集、VFAs和炎癥因子檢測、組織形態學分析、瘤胃上皮單細胞核RNA測序、瘤胃微生物宏基因組測序、瘤胃上皮轉錄組與miRNA測序、以及熒光定量PCR、Western Blot、雙熒光素酶報告基因實驗等分子生物學驗證。生物信息學分析涵蓋了差異表達分析、通路富集分析、相關性分析、網絡構建等。
結論
本研究首次闡明，瘤胃真菌家蠶曲霉通過增強硫胺素代謝，下調瘤胃上皮chi-miR-17-26080表達，進而解除對IGFBP2的抑制。上調的IGFBP2通過激活IGF1-PI3K/AKT和IGF1-ERK信號軸，促進瘤胃上皮細胞增殖，特別是增強VFAs吸收的基底層和棘層細胞，從而改善VFAs代謝，提升山羊對高精料誘導的SARA的耐受性。該發現揭示了瘤胃真菌代謝在反芻動物宿主代謝健康中的關鍵作用，為靶向微生物-宿主互作防治反芻動物代謝疾病提供了新策略。
