《Cancer Immunology, Immunotherapy》：TLR8 agonists remodel the tumor immune microenvironment through PF4-dependent T cell recruitment and ancillary mechanisms
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本文針對如何有效重塑腫瘤免疫微環境以提升抗腫瘤療效的難題，報道了對一系列模式識別受體激動劑的系統性篩選，并鑒定出TLR8激動劑是最有效的促免疫原性TIME誘導劑。研究發現其通過NF-κB信號通路上調PF4，進而經CXCR3通路募集cCD4+T細胞，并結合PF4非依賴機制抑制Treg和增強巨噬細胞吞噬，最終與抗PD-1療法產生協同效應，為腫瘤免疫聯合治療提供了新策略。
腫瘤治療領域，免疫療法已取得革命性進展，但如何克服“冷腫瘤”的免疫抑制微環境，將其轉變為對免疫攻擊敏感的“熱腫瘤”，仍是巨大的臨床挑戰。腫瘤免疫微環境是一個復雜的生態系統，其中，模式識別受體扮演著“哨兵”的角色，它們能感知危險信號并啟動免疫應答。理論上，激活這些受體（通過其激動劑）是重塑腫瘤免疫微環境的誘人策略。然而，問題在于：眾多不同的PRR激動劑中，哪一個才是重塑腫瘤免疫微環境、喚醒抗腫瘤免疫的最強“開關”？此外，血小板因子4在癌癥中表現出自相矛盾的雙重角色——既能抑制腫瘤，也能促進腫瘤，其在PRR信號調控下的功能更是迷霧重重。為了解決這些根本性問題，上海交通大學等機構的研究團隊在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上發表了一項系統性研究，旨在篩選最優的PRR激動劑，并深入解析其作用機制。
研究者為解答上述問題，主要運用了以下幾項關鍵技術：在C57BL/6和裸鼠皮下構建了AKR和MC38兩種腫瘤模型，進行體內藥效評價；利用多色流式細胞術全面分析腫瘤浸潤免疫細胞亞群的比例和功能狀態；通過單細胞RNA測序技術解析TLR8激動劑處理前后腫瘤免疫細胞在轉錄組層面的精細變化；采用細胞遷移實驗、噬菌實驗、雙熒光素酶報告基因檢測、RNA干擾等技術在體外驗證PF4的作用及TLR8-NF-κB-PF4信號軸。
TLR8激動劑在一系列PRR激動劑篩選中脫穎而出，能最優重塑腫瘤免疫微環境
研究人員首先在小鼠皮下腫瘤模型中，系統性地比較了靶向TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、STING、NOD1和NOD2的多種PRR激動劑。通過流式細胞術分析發現，雖然多數激動劑能增強樹突狀細胞和巨噬細胞對腫瘤抗原的吞噬及向淋巴結的遷移，但只有TLR8激動劑能夠同時顯著增加腫瘤中CD45+白細胞、CD8+T細胞和常規CD4+T細胞的浸潤，并降低調節性T細胞的比例，從而大幅提升效應T細胞與Treg的比值。這表明TLR8激動劑是誘導促免疫原性腫瘤免疫微環境的最全面、最有效的誘導劑。
TLR8激動劑通過誘導先天性和適應性免疫抑制腫瘤生長
為了確認效果的特異性，研究者使用了兩種不同的TLR8激動劑進行驗證。結果表明，二者均能重復上述免疫調節作用，并在免疫健全小鼠中顯著抑制腫瘤生長。值得注意的是，即使在缺乏T細胞的裸鼠中，TLR8激動劑仍能保留部分抗腫瘤活性，這表明其作用機制同時依賴于適應性免疫和先天性免疫。進一步的體外實驗證實，TLR8激動劑能強力促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬。
TLR8激動劑通過激活PF4-CXCR3通路塑造腫瘤免疫微環境
為了深入探索機制，研究者對TLR8激動劑處理后的腫瘤免疫細胞進行了單細胞RNA測序。分析顯示，Tlr8主要在腫瘤浸潤的巨噬細胞、cDC2（常規樹突狀細胞2型）和CD8+T細胞中表達。這些細胞在激動劑刺激后表現出更活躍的促炎和殺傷表型。關鍵的發現是，TLR8激動劑顯著上調了這些細胞中Pf4（血小板因子4）基因的表達。細胞通訊分析進一步表明，Pf4與其受體Cxcr3之間的配體-受體相互作用在激動劑處理后顯著增強，而Cxcr3在cCD4+T細胞上的表達也相應增加。這提示Pf4-Cxcr3化學趨化通路是TLR8激動劑招募cCD4+T細胞進入腫瘤的關鍵機制。
TLR8激動劑通過NF-κB信號通路誘導PF4表達
后續的機制研究聚焦于TLR8如何上調PF4。體外實驗表明，TLR8激動劑能顯著誘導小鼠和人類巨噬細胞中PF4的表達。信號通路研究表明，TLR8激活了其下游關鍵的NF-κB通路。當研究者利用RNA干擾技術敲低NF-κB關鍵亞基Rela/RELA后，TLR8激動劑誘導PF4表達的作用被完全阻斷。這確證了PF4是TLR8-NF-κB信號通路的一個直接下游靶點。
PF4重塑腫瘤免疫微環境并抑制腫瘤生長
為了驗證PF4在TLR8激動劑抗腫瘤效應中的功能，研究者在腫瘤細胞中過表達Pf4，以模擬其在腫瘤局部的上調。結果發現，局部Pf4過表達本身就能抑制腫瘤生長，并增強TLR8激動劑的效果。免疫分析顯示，Pf4過表達能增加腫瘤中CD45+細胞、cCD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤，提高效應T細胞/Treg比例，這些效應與TLR8激動劑部分重疊。然而，Pf4過表達會適度增加Treg，而TLR8激動劑則降低Treg，提示TLR8還存在不依賴于PF4的抑制Treg的機制（如誘導IFN-γ）。體外Transwell實驗直接證明，TLR8激動劑處理的巨噬細胞通過分泌PF4來促進T細胞遷移。
TLR8激動劑增強抗PD-1療法的療效
最后，研究者探索了TLR8激動劑與現有免疫療法聯合的潛力。在兩種腫瘤模型中，TLR8激動劑與抗PD-1抗體聯合治療，相比任一單藥，能更顯著地抑制腫瘤生長并延長荷瘤小鼠的生存期，顯示出強大的協同效應。
研究結論與討論歸納
本研究通過系統性篩選，確立了TLR8激動劑在重塑腫瘤免疫微環境方面的卓越效能。其核心機制是：TLR8激動劑通過激活NF-κB通路，誘導腫瘤局部巨噬細胞、cDC2和CD8+T細胞表達PF4；局部產生的PF4則通過CXCR3受體高效招募常規CD4+T細胞，從而優化TIME中的T細胞構成。此外，TLR8信號還通過PF4非依賴的途徑發揮作用，例如通過誘導IFN-γ來抑制Treg，以及直接增強巨噬細胞的吞噬功能，這解釋了其在T細胞缺陷小鼠中仍有效的現象。該研究的一個重要發現是澄清了PF4在癌癥中的背景依賴性雙重角色：由TLR8在腫瘤局部誘導產生的PF4主要發揮抗腫瘤作用，這與之前文獻報道的系統性PF4過表達所呈現的促瘤效應形成鮮明對比，強調了局部微環境對免疫分子功能的關鍵影響。
這項研究的意義重大。首先，它從比較學的角度為PRR靶向治療提供了清晰指引，將TLR8激動劑定位為連接先天與適應性免疫、全面優化TIME的極具潛力的候選藥物。其次，它深入闡明了TLR8-PF4-CXCR3這一新的抗腫瘤免疫軸，增進了對腫瘤免疫調節網絡的機制理解。最后，研究證實了TLR8激動劑與抗PD-1療法的協同作用，為設計更有效的腫瘤免疫聯合治療方案提供了堅實的臨床前依據。未來，如何實現TLR8激動劑的腫瘤靶向遞送以降低系統毒性，以及探索其與其他免疫療法的優化組合時序，將是推動其臨床轉化的關鍵方向。
