煙曲霉（Aspergillus fumigatus）產生的神經毒素（gliotoxin）因其對動物和人類的致病作用而受到了廣泛研究。該毒素通過免疫抑制和細胞毒性機制引發疾病。其生物合成過程由一個包含13個基因的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster，BGC）調控。我們利用CRISPR/Cas9系統對這一基因簇中的gliZ、gliP和gliA基因進行了多基因編輯，以研究其對肉雞的致病性。通過EuPaGDT設計crRNA，并購買了3種單導向RNA（sgRNA），每種sgRNA與Cas9結合形成核糖核蛋白復合物，用于同時轉染真菌原生質體。薄層色譜分析顯示硅芯片上不存在神經毒素，DNA測序結果顯示目標基因中存在多種插入或缺失突變。這些突變導致三個基因產物中的氨基酸發生替換，但gliP基因的突變屬于同義突變，因此可能不具有功能性影響。經過處理的原生質體成熟后形成了真菌菌絲，并誘導了孢子生成。將這些孢子接種到肉雞的氣囊中。在一周的感染試驗中，接種野生型孢子的雞（第1組）出現了病癥，死亡率為30%；接種RNP處理過的孢子的雞（第2組）僅表現出輕微的臨床癥狀，沒有死亡病例；陰性對照組（第3組）的雞未出現任何病癥或死亡。組織病理學分析顯示，野生型感染雞的肺部出現壞死和充血現象，以及炎癥細胞混合聚集，而接種RNP處理過的孢子的雞則未出現此類病變。這些結果表明，多基因編輯技術成功地在三個神經毒素基因中同時引入了插入或缺失突變，導致氨基酸替換，從而影響了神經毒素的生物合成和釋放。體內實驗結果表明，RNP處理過的真菌孢子無法在肉雞體內引發煙曲霉的致病性。因此，針對神經毒素生物合成機制進行干預可能是開發抗真菌療法的有效途徑。