牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病，主要特征是牙周組織破壞和牙槽骨吸收，是成年人牙齒喪失的主要原因。牙周膜干細胞（PDLSCs）是牙周組織中的多能干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，包括分化為成骨細胞、成纖維細胞和成牙骨質細胞等，是牙周組織工程中最常用的種子細胞。然而，炎癥微環境會通過多種機制損害PDLSCs的成骨分化潛能，包括改變細胞信號通路和代謝狀態。

線粒體作為細胞內ATP產生的主要場所，也是活性氧（ROS）的主要來源，在維持正常能量、氧化和代謝狀態中起關鍵作用。線粒體功能障礙被認為是牙周炎病理機制中的一個關鍵環節，包括線粒體DNA損傷、氧化應激、線粒體動力學失調以及自噬和線粒體自噬缺陷。研究已證實，在牙周炎微環境中，PDLSCs表現出明顯的線粒體功能障礙，包括ATP合成減少、線粒體膜電位降低和ROS水平升高，這共同導致了其再生潛能的受損。

FRZB（卷曲相關蛋白，又稱sFRP3）是分泌型卷曲相關蛋白（sFRP）家族成員，作為Wnt信號通路的拮抗劑，通過直接與Wnt配體結合來調節特定細胞的生長和分化。Wnt信號通路對干細胞成骨分化的調控至關重要。Wnt5a是Wnt家族成員，主要激活非經典Wnt通路，但在特定受體環境下也能激活經典的β-連環蛋白（β-catenin）通路。值得注意的是，在炎癥環境中，Wnt5a表達上調，這與PDLSCs成骨分化潛能降低相關。作為Wnt信號的分泌型拮抗劑，FRZB通過特異性結合Wnt5a并阻止其與受體相互作用，從而減弱下游信號傳導，是關鍵的負向調節因子。然而，FRZB在炎癥微環境中調控PDLSCs成骨分化的具體作用仍不明確。

本研究提出假設：炎癥微環境通過下調FRZB表達、繼而激活Wnt/β-連環蛋白信號通路并導致線粒體功能障礙，從而損害PDLSCs的成骨分化。

PDLSCs從健康牙齒的牙周膜組織中遷移出來，細胞密度隨時間逐漸增加。大多數細胞呈現均一的紡錘形形態，呈渦狀排列。流式細胞術分析顯示，PDLSCs高表達間充質標志物CD90和CD146，而造血標志物CD45表達極低，符合間充質譜系表型。CCK-8實驗表明，脂多糖（LPS）處理以劑量依賴的方式顯著損害細胞活力。此外，LPS刺激24小時后，炎癥細胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的表達水平顯著上調，呈劑量依賴性增加，并在10 μg/mL時達到峰值，證實LPS有效誘導了炎癥反應，建立了可靠的牙周炎體外模型。

經過21天的成骨誘導后，茜素紅染色顯示各實驗組有不同的礦化結節模式。α-MEM組未觀察到染色，而對照組則出現了大量深染的礦化結節沉積。相比之下，LPS組的結節形成明顯減少，與對照組相比，結節數量更少、染色更淺。與這些觀察結果一致，LPS組的光密度（OD）值顯著低于對照組。這些結果表明，LPS顯著損害了PDLSCs的成骨分化能力。

Western印跡分析顯示，LPS處理顯著下調了FRZB蛋白表達，并顯著增加了β-連環蛋白水平，而Wnt5a的表達未改變。分子對接進一步預測了介導FRZB與Wnt5a界面結合的特定氨基酸殘基。免疫共沉淀（Co-IP）證實了FRZB與Wnt5a之間存在直接相互作用。Western印跡和qPCR分析證實，與對照組相比，oe-FRZB組中FRZB水平有效升高，表明成功建立了FRZB過表達模型。

MitoTracker熒光染色顯示，對照組和oe-FRZB組的線粒體呈現密集的網狀結構，熒光信號強。相比之下，LPS組熒光強度減弱，網狀線粒體結構被破壞，而oe-FRZB+LPS組的線粒體結構和熒光強度均得到恢復。透射電子顯微鏡（TEM）結果進一步證實，LPS誘導的線粒體形態異常，包括碎片化、長度縮短、腫脹、直徑增加以及相互連接的管狀線粒體網絡斷裂成孤立的小球狀或短桿狀顆粒，這些異常均可被FRZB過表達逆轉。定量分析顯示，與對照組相比，LPS組的相對熒光強度和線粒體分支長度顯著降低，而線粒體分支直徑顯著增加。相反，與LPS組相比，oe-FRZB+LPS組的這些變化得到部分恢復。Western印跡分析顯示，線粒體外膜蛋白Tom20在對照組和oe?FRZB組之間表達無顯著差異。然而，Tom20在LPS組和oe?FRZB+LPS組中表達均顯著降低，后者降低更為明顯。這種降低可能是由于線粒體損傷后Tom20解離到細胞質中隨后被降解所致。線粒體呼吸鏈蛋白COXIV在LPS組表達降低，但在oe-FRZB+LPS組得到恢復，證實FRZB過表達可減輕LPS誘導的線粒體呼吸功能損傷。

JC-1線粒體膜電位檢測顯示，對照組和oe-FRZB組呈現強烈的紅色熒光和微弱的綠色熒光。相比之下，LPS組呈現強烈的綠色熒光和微弱的紅色熒光。與單獨的LPS組相比，oe-FRZB+LPS組的紅色熒光恢復，綠色熒光減少。這種現象表明LPS處理降低了線粒體膜電位，而過表達FRZB可能部分緩解LPS引起的線粒體膜電位下降。通過觀察不同實驗組中線粒體膜電位、線粒體鈣離子濃度和ROS水平的變化發現，在對照組中，線粒體膜電位正常，ROS水平穩定，線粒體Ca²⁺濃度維持在基線水平。oe-FRZB組與對照組相比，這些參數無顯著差異。相比之下，LPS組表現出明顯的線粒體膜電位喪失、線粒體Ca²⁺顯著升高以及ROS水平大幅增加。值得注意的是，與LPS組相比，oe-FRZB+LPS組表現出膜電位恢復的趨勢，線粒體鈣積累減少，ROS產生降低，這表明FRZB過表達減輕了LPS誘導的線粒體功能障礙。

Western印跡分析顯示，LPS刺激下調了線粒體自噬相關蛋白（Pink1和Parkin）及自噬銜接蛋白P62的表達，同時上調了β-連環蛋白的表達。相反，在oe-FRZB組和LPS+oe-FRZB組中觀察到相反的趨勢。這些發現表明，炎癥條件激活了Wnt/β-連環蛋白信號通路，可能抑制了自噬和線粒體自噬。過表達FRZB似乎能減弱這些效應。

mCherry-GFP-LC3雙熒光染色和Western印跡分析顯示：在對照組中，豐富的黃色熒光表明存在一定數量的自噬體。oe-FRZB組與對照組相比，黃色斑點的分布和數量相似，表明FRZB過表達未顯著影響基礎自噬活性。在LPS組中，觀察到黃色斑點顯著減少，同時紅色熒光減少，LC3II/LC3I比率下調，這表明LPS可能抑制了自噬流或破壞了自噬體成熟和降解，導致自噬體積累減少。在oe-FRZB+LPS組中，黃色斑點明顯恢復，紅色熒光部分增強，LC3II/LC3I比率高于LPS組。此外，與對照組和oe-FRZB組相比，LPS組中的自噬體和自溶體數量顯著減少。相比之下，oe-FRZB+LPS組與LPS組相比，自噬體和自溶體數量顯著增加。這些結果表明，在LPS誘導的自噬受損條件下，FRZB過表達可能恢復自噬活性并促進自噬體形成和/或成熟。

經過21天的成骨誘導后，對照組PDLSCs表現出明顯的深紅色結節。相比之下，LPS組的結節較小且染色較淺。oe-FRZB組與對照組相似，具有類似的深紅色結節。值得注意的是，與LPS組相比，LPS+oe-FRZB組的結節形成增加，紅色染色更深。定量分析顯示，LPS組的光密度（OD₅₆₂）值顯著低于對照組和oe-FRZB組。相反，LPS+oe-FRZB組的OD值明顯高于LPS組。這些結果表明，LPS誘導的牙周炎條件抑制了PDLSCs的成骨潛能，而FRZB過表達能有效挽救炎癥挑戰下的成骨分化。

由于多因素發病機制，牙周炎中的牙槽骨吸收仍然是一個主要的治療挑戰。在炎癥微環境下，PDLSCs的成骨分化能力明顯受損。考慮到其可及性、高增殖潛力和多能性，PDLSCs是再生應用的有希望的候選者。特別是其成骨潛能對于與牙周炎相關的骨缺損再生至關重要。

PDLSCs的表面分子標記分析（CD45?/CD90?/CD146?）證實了其間充質來源和干細胞樣特性。CCK-8實驗顯示，炎癥微環境顯著抑制了PDLSCs的增殖和活力。在茜素紅染色實驗中，與對照組相比，LPS組的礦化結節尺寸減小、染色強度降低，表明成骨分化受損——這與牙周炎患者牙槽骨丟失和成骨缺陷的臨床觀察一致。相比之下，LPS+oe-FRZB組與LPS組相比，形成了更多、染色更深的礦化結節。這些結果表明，FRZB過表達挽救了炎癥條件下PDLSCs的成骨潛能。

本研究通過免疫共沉淀實驗證實了FRZB與Wnt5a之間的相互作用。分子對接進一步闡明了介導它們結合的特定氨基酸殘基。某些卷曲受體，包括FZD4、FZD5和FZD7，已知可與Wnt5a結合并激活經典和非經典Wnt信號通路。值得注意的是，FRZB包含一個與卷曲受體結構相似的富含半胱氨酸的結構域（CRD）。通過該結構域，FRZB結合細胞外Wnt配體，并競爭性抑制其與卷曲受體的相互作用，從而抑制下游信號傳導。在本研究中，LPS處理導致β-連環蛋白表達顯著增加，同時FRZB表達減少。這些發現表明，炎癥微環境可能下調FRZB表達，激活Wnt/β-連環蛋白信號通路，從而損害PDLSCs的成骨分化潛能。

此外，LPS處理的PDLSCs表現出線粒體超微結構破壞，同時伴隨線粒體膜電位升高、線粒體鈣積累增加和ROS產生增強。相比之下，過表達FRZB有效減輕了這些病理變化。總之，這些發現表明炎癥微環境損害了PDLSCs的線粒體功能。線粒體自噬作為一種選擇性自噬，有助于清除受損的線粒體，從而保護細胞免于凋亡。在本研究中，LPS處理導致PINK1、Parkin和P62的下調，以及LC3-II/LC3-I比率的降低。這些發現表明，自噬失調可能損害PDLSCs的成骨分化潛能。提出的機制是：LPS誘導的線粒體自噬抑制，損害了細胞對受損線粒體的清除。因此，這些線粒體積累并釋放ROS和促凋亡因子，促進細胞死亡或凋亡，這反映在PINK1和Parkin表達的減少上。此外，LPS似乎破壞了自噬流，證據是LC3-II降解增強以及LC3-I向LC3-II轉化受損，導致LC3表達減少、自噬體減少以及整體自噬抑制。這種自噬功能障礙可能進一步加劇細胞內氧化應激，從而減弱PDLSCs的成骨能力。總之，這些結果表明，炎癥微環境通過誘導線粒體功能障礙來抑制PDLSCs的成骨分化。這一觀察與之前的報告一致，即牙周炎炎癥環境中PDLSCs的線粒體損傷導致成骨潛能降低。

值得注意的是，本研究證實，過表達FRZB基因可在炎癥條件下部分恢復線粒體功能。其機制涉及：牙周炎期間，Wnt5a與細胞膜上的卷曲受體結合，同時激活Wnt/β?連環蛋白信號通路。這種激活促進了β?連環蛋白的核積累，從而通過TCF4等轉錄因子抑制P62/SQSTM1基因的轉錄，直接降低p62 mRNA水平和從頭蛋白質合成。同時，在炎癥條件下，自噬過程被抑制，通過自噬-溶酶體途徑降解p62受阻，理論上會導致p62積累。然而，在本研究的特定實驗體系和處理時間范圍內，Wnt/β?連環蛋白信號激活后由TCF4介導的p62轉錄抑制效應，超過了因自噬抑制導致的p62降解減少效應，最終導致總p62蛋白水平下降。當P62轉錄減少時，即使上游PINK1/Parkin通路被激活并標記了受損線粒體，缺乏p62作為媒介也會阻止這些標記的線粒體被有效封裝到自噬體中進行降解。這直接導致受損線粒體在細胞內積累，造成線粒體功能障礙。

當Wnt蛋白與FZD受體和LRP5/6共受體結合時，GSK3β會磷酸化LRP5/6的胞質區。這導致Dvl和axin蛋白分別被募集到Frizzled和LRP5/6受體的胞質域。激活的Dvl破壞破壞復合體并抑制GSK3β介導的β-連環蛋白磷酸化，從而阻止其降解。因此，β-連環蛋白在細胞質中積累，易位到細胞核，并與TCF轉錄因子結合，從而抑制P62的轉錄和表達。P62的下調降低了PINK1的穩定性和激活，損害了Parkin的募集和激活，阻斷了線粒體自噬通路，最終導致線粒體功能障礙。相比之下，FRZB可以通過同時結合Wnt蛋白和卷曲受體來抑制Wnt信號。在炎癥條件下，FRZB的下調激活了Wnt/β-連環蛋白通路，從而導致線粒體功能障礙。

總之，本研究闡明了一種炎癥微環境調控PDLSCs成骨的潛在機制，為牙周炎的發病機制提供了新的見解。我們的研究結果表明，FRZB通過調節Wnt信號通路來調節線粒體功能，包括ROS生成、凋亡和線粒體自噬，從而決定了炎癥條件下PDLSCs的成骨能力。然而，仍需考慮一些局限性：1）雖然本研究通過體外實驗提供了關鍵見解，但目前采用的LPS體外模型無法完全復制體內牙周炎的復雜微環境。未來仍需通過動物實驗等方法進行驗證，以確定這些發現的病理生理相關性；2）盡管FRZB-Wnt5a-線粒體軸是一條關鍵的調控通路，但炎癥微環境中調控成骨分化的機制可能涉及復雜的多通路、多因素相互作用。因此，全面剖析這一復雜的調控網絡將需要跨多個實驗模型的綜合方法。

在本實驗中，體外炎癥微環境模型的建立揭示了PDLSCs成骨分化能力受到顯著抑制。這種抑制似乎是由炎癥條件下FRZB的下調所介導的，其激活了Wnt/β-連環蛋白信號通路，導致線粒體功能障礙。總之，這些結果表明，炎癥微環境通過FRZB-Wnt5a-線粒體軸調節PDLSCs的成骨分化，為開發針對牙周炎的治療策略提供了新的機制見解。

PDLSCs從健康捐贈者（年齡18–30歲）拔除的阻生第三磨牙中分離。所有程序均經南昌大學附屬口腔醫院倫理委員會批準（許可號：2023011），并獲得了所有捐贈者的書面知情同意。排除標準包括嚴重齲齒、根尖周或牙周病變、吸煙史和使用某些藥物。拔牙后立即將牙齒浸入含有抗生素的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。從牙根表面輕輕刮取牙周膜組織，切成1–2 mm³的小塊，并均勻鋪在培養皿中。讓組織塊在培養皿表面粘附2–4小時，然后小心添加完全生長培養基（α-MEM補充20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素溶液）。培養物在37°C、5% CO?的加濕培養箱中維持，每2–3天更換一次培養基，直到細胞從組織塊中遷移出來并達到匯合。使用第3代（P3）PDLSCs進行鑒定。對于流式細胞術，將細胞以1×10⁵/mL的密度接種在6孔板中，在70–80%匯合度時收集，并與針對FITC-CD45、FITC-CD146、PE-CD90的熒光標記抗體在4°C孵育30分鐘。PBS洗滌后，使用全光譜多色流式細胞儀分析表面標志物表達。使用FlowJo軟件（版本10）進行數據分析。

為建立炎癥細胞模型，將PDLSCs培養至80%匯合度，并用不同濃度（0、2、5、10 μg/mL）的脂多糖（LPS）處理以誘導促炎反應。

通過Western印跡分析測定炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的蛋白水平。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）測定細胞活力，將細胞與CCK-8試劑孵育后測量450 nm處的吸光度（光密度，OD）。實驗組之間OD值的差異表明了LPS處理對細胞活性的影響。

PDLSCs在成骨誘導培養基OIM（α-MEM、10% FBS、10 mM β-甘油磷酸酯、50 μg/mL抗壞血酸和100 nM地塞米松）中培養21天，每3天更換一次培養基。實驗組包括：1）α-MEM組：僅使用不添加成骨誘導因子的α-MEM基礎培養基培養。2）對照組：僅在OIM中培養。3）LPS組：在補充了10 μg/mL LPS的OIM中培養。4）過表達FRZB組（oe-FRZB組）：用攜帶FRZB過表達質粒的慢病毒載體轉染PDLSCs，并在OIM中培養。5）過表達FRZB+LPS組（oe-FRZB+LPS組）：用攜帶FRZB過表達質粒的慢病毒載體轉染PDLSCs，并在補充了10 μg/mL LPS的OIM中培養。

21天后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，用PBS洗滌，然后用1%茜素紅溶液（pH 4.2）染色10分鐘。PBS洗滌后對礦化結節進行拍照。使用10%十六烷基氯化吡啶鎓溶解鈣結節。完全溶解后，將其加入96孔板，測量562 nm波長處的OD值。

各組細胞分別用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、活性氧熒光染料（DCFH-DA）和線粒體鈣離子檢測試劑盒（Rhod-2 AM）在37℃、5% CO?條件下避光染色30分鐘。染色后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。此外，使用多功能酶標儀測量各組細胞懸浮液的熒光強度，定量分析線粒體膜電位、ROS水平和線粒體鈣離子濃度的變化。

處理24小時后，用無血清培養基洗滌細胞，并與1 μM Mito-Tracker Red CMXRos（37 °C，30分鐘，避光）孵育。洗滌兩次后，用1 μg/mL Hoechst 33,342（5分鐘，避光）復染細胞核。再洗滌三次后，用抗淬滅封片劑封片，使用激光掃描共聚焦顯微鏡成像。

用5 MOI Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細胞48小時以表達熒光標記蛋白。吸棄培養基，用無血清培養基洗滌細胞兩次。使用封片劑封閉細胞樣品。通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光斑點（指示自噬體）。

各組細胞離心形成約綠豆大小的細胞團，然后用電子顯微鏡固定液重懸。使用環氧樹脂812作為包埋介質對樣品進行脫水和包埋。然后將包埋的標本切成厚度為60–80 nm的超薄切片。將染色的切片安裝在銅網上用于電子顯微鏡以完成樣品制備。使用透射電子顯微鏡觀察和分析線粒體的超微結構形態。

用RIPA裂解緩沖液裂解PDLSCs，使用BCA蛋白測定試劑盒定量蛋白濃度。蛋白質通過10% SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1小時后，將膜在4°C下與針對以下靶標的一抗孵育過夜：Wnt5a、β-連環蛋白、PINK1、Parkin、LC3B和P62。第二天，用TBST洗滌膜，并與HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L）/抗小鼠IgG（H+L）在室溫下孵育1小時。使用增強化學發光試劑顯影蛋白條帶，并用化學發光檢測系統成像。通過光密度定量評估蛋白表達水平。

取適量的PDLSCs裂解液，分別與Wnt5a和FRZB抗體在4°C孵育過夜。然后加入Protein A/G磁珠，混合物孵育2小時。隨后使用磁力架分離珠子并進行洗滌。之后，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘解離免疫復合物。通過Western印跡分析觀察FRZB與Wnt5a之間的相互作用。通過分子對接技術模擬了Wnt5a和FRZB蛋白大分子的結合位點。

所有實驗至少進行三次重復，結果以均值±標準差（SD）表示。兩組比較使用雙尾非配對Student's t檢驗。三組或以上比較采用單因素方差分析（ANOVA）。所有統計分析均使用GraphPad Prism 9版進行。統計顯著性閾值設定為p< 0.05。