《Microbiology Spectrum》：Iron amendment decreases methane emissions from subtropical paddies by altering soil microbial communities
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本研究通過為期四年的田間試驗，揭示了在減少氮（N）肥用量的同時添加鐵（Fe）粉，能有效降低亞熱帶稻田甲烷（CH4）排放。其核心機制在于，Fe添加通過降低產甲烷菌與甲烷氧化菌的基因豐度比（mcrA/pmoA），改變兩者群落構建過程及共現網絡，從而抑制CH4生成。研究發現土壤Fe2+含量和產甲烷菌群落結構是驅動CH4排放的關鍵因素。該成果為實現稻田“減肥”減排提供了微生物學依據和新思路。
引言：稻田甲烷排放與調控挑戰
甲烷（CH4）是僅次于二氧化碳的重要溫室氣體，淹水稻田是其主要來源之一。過量施用氮（N）肥會加劇CH4排放，帶來一系列環境問題。因此，減少合成氮肥使用已成為中國“化肥使用量零增長行動”的國家戰略目標。然而，長期減氮可能影響水稻產量。鐵（Fe）作為土壤中重要的電子受體，可參與氧化還原反應，抑制產甲烷菌活性。但關于減氮背景下Fe添加對稻田CH4排放、產甲烷菌和甲烷氧化菌的影響，目前認知仍很有限。本研究通過四年原位田間試驗，旨在闡明：（1）減氮與Fe添加對CH4排放的影響；（2）土壤中產甲烷菌與甲烷氧化菌的響應；（3）驅動CH4排放的關鍵微生物類群與土壤理化因子。
材料與方法
試驗在中國江蘇省南京市六合區（32°21′N, 118°51′E）進行，該地為稻麥輪作區，屬亞熱帶季風氣候。試驗為期四年（2020–2023），設置了七個處理：常規氮肥用量（315 kg N hm-2）的100%、80%、60%和0%（100%N, 80%N, 60%N, 0%N），以及80%、60%和0%氮肥用量結合Fe粉（零價鐵，純度≥99%）添加的處理（80%N+Fe, 60%N+Fe, 0%N+Fe）。Fe粉于2019年水淹前以5000 kg hm-2施入土壤表面并氧化。每個處理設四次重復。
使用密閉箱法測定各田塊的CH4通量，在水稻生長季定期采樣，并通過氣相色譜儀分析CH4濃度，計算通量與累積排放量。在水稻關鍵生育期（如分蘗期、拔節期）采集耕層土壤（0–20 cm），測定pH、電導率（EC）、總氮（TN）、銨態氮（NH4+–N）、亞鐵（Fe2+）等理化性質。利用實時熒光定量PCR（qPCR）技術檢測16S rDNA、產甲烷菌標記基因mcrA和甲烷氧化菌標記基因pmoA的拷貝數。對2022–2023年水稻季的土壤DNA樣品進行mcrA和pmoA基因的高通量測序，分析微生物群落組成、多樣性、構建過程及共現網絡。使用中性群落模型評估群落構建中的隨機過程重要性，并通過隨機森林模型等統計方法分析影響CH4排放的關鍵驅動因子。
結果
CH4排放動態
在早期淹水期，尤其是分蘗期，觀察到CH4脈沖排放峰。Fe添加顯著影響了2020、2022和2023年水稻季峰值期的平均CH4通量。例如，2020年，60%N+Fe和80%N+Fe處理比相應未加Fe處理的平均CH4通量分別降低了55.21%和66.20%。在2023年水稻季，60%N+Fe處理比其對應的60%N處理的累積CH4排放量降低了43.79%，比100%N處理降低了57.33%。方差分析表明，Fe添加而非氮肥減量，是影響累積CH4排放的關鍵因素。
微生物基因豐度與比例
Fe添加對mcrA和pmoA基因的絕對或相對豐度在多數時期無顯著統計學影響。然而，Fe添加顯著降低了整個2023年水稻季的mcrA/pmoA比值，從未加Fe處理的3.31降至加Fe處理的1.62。這表明Fe添加改變了產甲烷菌與甲烷氧化菌之間的平衡，有利于抑制CH4凈排放。
產甲烷菌與甲烷氧化菌群落特征
在門水平上，產甲烷菌群落主要由Methanobacteriota（93.57%–99.52%）組成。在屬水平上，主要類群包括Methanobacterium、Methanothrix等。甲烷氧化菌群落則主要由Pseudomonadota（90.17%–92.44%）組成，主要屬包括Methylocystis、Methylosinus等。2023年水稻季的核心操作分類單元（ASV）數量多于2022年。群落組裝分析顯示，在60%常規氮肥水平下，Fe添加增強了產甲烷菌群落構建的隨機過程，但降低了其擴散；對甲烷氧化菌群落的影響則呈現相反趨勢。在80%常規氮肥水平下，Fe添加增強了甲烷氧化菌群落的隨機性。
差異物種、專家種與共現網絡
在產甲烷菌群落中鑒定出16個差異豐度ASV，其中15個在Fe添加下上調，1個下調。共發現10個專家種（特異性與占有率均≥0.7），其中60%N+Fe處理的專家種數量最多（n=5）。甲烷氧化菌群落中鑒定出16個差異ASV，并發現2個專家種。共現網絡分析表明，無論是產甲烷菌還是甲烷氧化菌群落，Fe添加都導致網絡具有更多的邊、更高的平均度和更低的模塊化程度，意味著微生物間的連接性增強，模塊化結構減弱。有趣的是，僅在未加Fe的處理中，特定模塊（如產甲烷菌的模塊5）的相對豐度與累積CH4排放呈顯著正相關，而甲烷氧化菌的模塊2與之呈負相關，這表明Fe添加可能削弱了模塊在調控CH4排放中的作用。
驅動CH4排放的關鍵因素
Mantel相關分析表明，影響產甲烷菌豐度的關鍵環境因子主要是總氮（TN）和Fe2+含量。影響甲烷氧化菌群落多樣性的關鍵因子是Fe2+含量，而影響其群落結構的關鍵因子是NH4+–N含量。隨機森林模型進一步指出，mcrAPCoA2（表征產甲烷菌群落結構）、氧化還原電位（Eh）、pH、16S rDNA豐度、碳氮比（C/N）和mcrA/16S rDNA比值是影響CH4通量的重要預測因子。而土壤Fe2+含量、mcrA基因豐度和NH4+–N含量是影響累積CH4排放的關鍵驅動因子。回歸分析證實，mcrAPCoA2和Fe2+含量分別與CH4通量和累積排放量呈顯著負相關。
討論
減氮與Fe添加對CH4排放及微生物的影響
本研究發現，Fe添加而非單純減氮，是顯著降低CH4排放的主因。這凸顯了氮管理與產甲烷過程相互作用的復雜性，以及Fe在抑制亞熱帶稻田CH4排放中的重要作用。以往研究表明，單一Fe氧化物施用可在一定程度上減少稻田CH4排放，本研究進一步證實，在長期減氮條件下，Fe粉添加能顯著降低排放。結合減氮與Fe添加不僅能減少CH4排放，還能增強生物固氮、維持水稻產量，為水稻綠色低碳生產提供了新方案。
Fe添加降低了mcrA/pmoA比值。在厭氧條件下，Fe3+還原過程會與產甲烷過程競爭電子，從而抑制產甲烷菌生長。同時，高濃度Fe2+會抑制Fe3+還原，減少鐵結合有機碳釋放的可溶性有機碳（DOC），進一步限制產甲烷菌底物供應。此外，Fe添加改變了產甲烷菌和甲烷氧化菌群落的構建機制。在60%氮肥水平下，Fe添加增強了產甲烷菌群落的隨機過程，但削弱了確定性過程對甲烷氧化菌的影響，這反映了微生物對不同施肥模式的復雜響應。
驅動排放的關鍵類群與土壤因子
土壤Fe2+含量是驅動累積CH4排放的關鍵環境因子。本研究還發現，當土壤Fe2+含量高時，甲烷氧化菌群落多樣性也增加，這可能間接影響了CH4排放。
關鍵微生物類群可能通過調節代謝途徑直接影響CH4通量。例如，在Fe添加與未添加處理間差異顯著的ASV2385、ASV2330和ASV2856均屬于Methanobacteriota門，其中ASV2330屬于Methanobacterium屬。鐵是Methanobacterium生長的關鍵限制因子，直接影響CH4產生。此外，專家種ASV273（60%N處理中最關鍵的類群）的相對豐度與累積CH4排放密切相關，這可能是60%N處理比60%N+Fe處理排放更高的一個重要原因。
Fe添加增強了產甲烷菌和甲烷氧化菌共現網絡的連通性，降低了模塊化程度。隨著確定性過程減弱，種間競爭可能減弱，導致微生物間共現關系增加，網絡連接性增強。值得注意的是，僅在未加Fe處理中，特定網絡模塊與CH4排放顯著相關，而Fe添加削弱了模塊的作用，這可能意味著個體物種在網絡中的功能得到增強。本研究明確了產甲烷菌群落結構在調控CH4通量中的重要性，mcrA基因豐度也與累積排放量密切相關。
結論
為期四年的田間研究表明，Fe添加結合減氮施肥（尤其是減少40%氮肥用量的60%N+Fe處理）能顯著降低亞熱帶稻田CH4排放（降幅約57%），同時維持水稻產量。其減排機制主要在于：Fe添加顯著降低了產甲烷菌與甲烷氧化菌的基因豐度比（mcrA/pmoA）；改變了兩種功能微生物群落的構建過程（如在60%氮肥下增強產甲烷菌群落的隨機性）；并增加了其共現網絡的連通性，降低了模塊化。土壤Fe2+含量和產甲烷菌群落結構是驅動CH4排放的關鍵因素。綜上所述，減少合成氮肥施用并結合Fe添加，為緩解亞熱帶稻田CH4排放提供了一種新途徑，有助于推動氣候智能型農業發展。
