即食食品在全球市場迅速普及，脫骨雞爪（PDCF）作為一種富含膠原蛋白、質地獨特的高附加值產品，市場需求巨大。中國是雞爪的主要消費國與進口國，僅2024年就進口了約44.9萬噸冷凍雞爪。PDCF具有高水分、高蛋白（膠原蛋白約占總蛋白54%）、無防腐劑、依賴冷鏈等特點，使其在生產與貯藏過程中極易受到微生物污染，導致腐敗變質，嚴重威脅食品安全并損害其核心的彈性質構。因此，尋找一種既能有效殺菌、延長貨架期，又能最大限度保持產品質構的加工技術至關重要。當前肉類減菌技術主要分為熱加工（如巴氏殺菌、微波）和非熱加工（如電子束輻照、超聲、高壓處理）。傳統熱處理成本低、操作簡單，但高溫常導致質構劣變；巴氏殺菌溫度較低，能更好地保持風味營養；微波兼具熱與非熱效應。非熱加工技術能有效殺滅微生物并較好地保持甚至改善食品品質，如電子束輻照（EBI）利用高能電子束破壞微生物遺傳物質，超聲（US）依靠空化效應破壞細胞結構，高壓處理（HPP）則通過破壞蛋白質結構實現高效滅菌并可能增強風味。目前，對肉類產品減菌后菌群的分析多依賴第二代測序技術，其讀長短限制了鑒定準確性。相比之下，Pacific Biosciences（PacBio）單分子實時（SMRT）測序技術可獲得16S rRNA基因全長序列，能更精確地揭示樣品內的物種多樣性。然而，應用PacBio SMRT測序研究PDCF減菌處理后微生物群落組成的工作尚少。準確識別減菌后的微生物群落對于評估處理效果和識別腐敗或致病菌的潛在風險至關重要。需要強調的是，細菌多樣性指數的降低并不等同于微生物安全性的提高，全面的安全性評估需綜合考慮總活菌數、存活菌群的組成與相對豐度以及生物標志物。盡管各種減菌技術在肉類保鮮中已有廣泛研究，但針對高膠原含量的PDCF的系統評估，特別是加工對其細菌群落影響的研究仍顯不足。因此，本研究選取HTST、LTLT和MW作為熱處理的代表，并輔以EBI、US和HPP三種非熱處理，系統研究不同微生物減菌處理對PDCF品質和細菌群落的影響，旨在為PDCF及類似高膠原肉類產品選擇高效低損的減菌處理提供科學依據，并為其微生物安全與品質穩定奠定理論基礎。

真空包裝的PDCF樣品購自中國四川自貢一家本地食品公司，共21袋，每袋250克。樣品在-18°C冷凍條件下快速運至實驗室，并立即隨機分為七組，每組三個樣品：對照組（CG）、電子束輻照組（EBI）、超聲處理組（US）、高壓處理組（HPP）、高溫短時巴氏殺菌組（HTST）、低溫長時巴氏殺菌組（LTLT）和微波處理組（MW）。各方法的操作參數通過預實驗并參考文獻確定，旨在實現顯著的微生物滅活同時保持雞爪的感官和質構品質。處理后，所有樣品在4°C冰箱中儲存直至分析。

通過平板計數法測定總活菌數（TVC）。使用質構分析儀測量PDCF樣品第三指第三節骨處的剪切力。肌原纖維碎片化指數（MFI）的測定參考已有方法并稍作修改。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察PDCF表面的微觀結構。感官評價由20名經過培訓的成員（10男10女，年齡20-30歲，平均24歲）自愿參與，對色澤、質地、外觀、滋味、氣味和總體可接受度進行評分，總感官評分為各屬性的加權和。

使用試劑盒提取PDCF樣品的基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop評估其質量與純度。使用引物27F和1492R對16S rRNA基因全長進行PCR擴增，擴增產物純化、定量后等量混合，使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0建庫，并在PacBio Sequel II平臺上進行測序。測序后，使用USEARCH將合格序列按97%相似度聚類為操作分類單元（OTUs），并在QIIME 2中使用基于SILVA數據庫的樸素貝葉斯分類器進行物種注釋。在QIIME 2中計算Alpha和Beta多樣性，并通過單因素方差分析評估組間微生物豐度差異。此外，采用線性判別分析（LDA）和線性判別分析效應量（LEfSe）來識別差異豐度的分類單元。所有測序數據均在BMKCloud平臺分析，并使用R軟件生成圖形輸出。

三個生物學重復的數據通過SPSS 27.0進行單因素方差分析，隨后進行Tukey’s HSD多重比較檢驗。在進行方差分析前，評估了數據的正態性和方差齊性。對于微生物群落相對豐度數據，我們認識到其組成性質，因此方差分析結果結合基于LEfSe的生物標志物分析進行解讀。數據圖形使用Origin 2024b生成。

總活菌數是評估減菌過程效果的關鍵指標。對照組的TVC為2.44 ± 0.12 log CFU/g。所有減菌處理均顯著降低了TVC。其中，電子束輻照（EBI）表現最為有效，TVC僅為0.10 ± 0.03 log CFU/g，顯著低于其他處理。這主要歸因于EBI利用高能電子束穿透微生物細胞，破壞其DNA結構，從而阻止復制增殖。高壓處理（HPP）的殺菌效果次之，TVC為0.39 ± 0.08 log CFU/g。該水平遠低于報道的冷藏熟制禽肉產品腐敗閾值（6-7 log CFU/g）以及中國國家標準（GB 2726-2016）對熟肉制品≤5 log CFU/g的限制。同樣，超聲（US）和熱處理（HTST、LTLT、MW）的TVC也低于此限值。HPP通過高壓處理對細胞結構造成不可逆損傷來實現微生物滅活。相比之下，US的效果不如EBI和HPP。據報道，US常與其他處理（如熱或化學處理）結合使用以增強其效果，單獨使用時效果有限。此外，熱處理主要通過熱誘導的酶和蛋白質損傷導致微生物死亡。在本研究中，微波（MW）的殺菌效果顯著優于LTLT和HTST，這可能是由于其同時依賴于熱效應和電場強度產生的非熱效應。

PDCF特有的嫩度是其食用品質的關鍵決定因素。剪切力是評估肉類嫩度的常用指標，而MFI間接反映了肌原纖維結構的完整性，與嫩度密切相關。對照組的剪切力為1.09 ± 0.04 N。所有減菌處理均顯著降低了剪切力，表明處理導致了PDCF的組織軟化。總體而言，剪切力與MFI呈強負相關，表明加工過程中肌原纖維破碎的增加與質地變軟直接相關。這與之前在冷凍雞爪和羊肉中的觀察結果一致，即較高的MFI伴隨著儀器測量韌性的降低。

EBI處理后，PDCF的剪切力降至0.94 ± 0.03 N，而MFI增至24.8 ± 0.49。EBI組的剪切力和MFI值最接近對照組，表明其對PDCF嫩度的影響最小。相比之下，HPP處理將剪切力降至0.77 ± 0.01 N，并將MFI增至25.30 ± 0.35。與EBI、US、HPP等非熱加工相比，所有熱處理均導致剪切力顯著下降、MFI顯著增加，表明熱處理對PDCF嫩度的保持有明顯不利影響。這可能歸因于熱處理過程中嚴重的水分損失和蛋白質二級結構的改變，導致肌原纖維破碎增加，從而降低了剪切力。

不同微生物減菌處理對PDCF表面微觀結構的影響如圖3所示。對照組表面呈現均勻分布、形態完整的突起，主要由肌纖維束和結締組織構成。EBI處理后，突起保持最為完整，僅部分輕微融合，呈現不規則外觀，整體形態與對照組非常接近。這種相對的結構完整性與其較高的剪切力表現一致。US導致突起數量顯著減少，尺寸明顯變小，同時表面孔隙增加。HPP引起突起輕微融合，排列更緊密，整體呈現壓縮和致密化趨勢。HTST導致突起廣泛融合，形成聚集的塊狀結構，孔隙進一步擴大。LTLT處理后，突起基本消失，表面轉變為由細小顆粒單元組成的結構，整體質地相對疏松。在MW處理中，突起幾乎完全消失，留下相對光滑的表面和大量細小的孔隙，這可能是由于微波過熱損傷了肌纖維。

總之，不同的微生物減菌處理對PDCF的微觀結構造成了不同程度的損傷。EBI較好地保持了結構完整性，而HPP促進了結構致密化。通常，更完整的結構和更致密的肌纖維網絡對應更高的肌肉韌性，可能導致更好的剪切力性能，以及改善的咀嚼性和彈性。相比之下，在US和熱處理中觀察到的微觀結構改變，如突起消失、孔隙率增加和表面光滑化，可能是導致儀器測量剪切力下降、感官彈性降低和質地軟化的關鍵因素。

不同的微生物減菌處理顯著影響了PDCF的感官品質。在所有接受感官評價的減菌處理中，HPP在所有屬性上均獲得了最高分：色澤、質地、外觀、滋味、氣味和總體可接受度。因此，其總感官評分顯著高于所有其他處理，并且最接近對照組。值得注意的是，盡管HPP的儀器測量剪切力顯著低于EBI，但其質地評分卻明顯更高。這表明HPP誘導的適度質地軟化并未超過PDCF的質地偏好閾值，反而落入了能綜合優化嫩度、多汁性和彈性感知的理想范圍。這種感官優勢與微觀結構和MFI值的變化相符。HPP處理導致MFI值適度增加以及肌原纖維蛋白輕微融合，共同促成了更受偏好的彈性和咀嚼性。此外，先前研究表明HPP有助于釋放肉制品中的小分子風味化合物，從而增強香氣和滋味，這進一步支持了其在滋味和氣味類別中的較高得分。

在其他處理中，總感官評分未觀察到顯著差異。值得注意的是，在非熱加工中，總分為7.31 ± 0.20的EBI在滋味和氣味上得分最低，與對照組明顯偏離。這與之前高劑量輻照可誘導酚類化合物分解和含硫氨基酸降解，形成具有特征性不良氣味的揮發性硫化合物的報道一致。因此，盡管EBI在剪切力、MFI值和微觀結構上保持得與對照組最相似，但強烈的不良氣味仍導致總體可接受度降低。此外，US和熱處理的質地評分普遍較低，這與其較低的剪切力、較高的MFI值和更明顯的微觀結構損傷一致。

本研究采用PacBio SMRT測序技術分析PDCF的細菌群落組成。稀疏曲線和香農指數曲線均趨于平緩，表明測序數據量充足且深度足夠，可靠地捕獲了PDCF中的微生物組成。所有樣品的覆蓋度均超過0.999，進一步證實測序結果能準確代表PDCF中的微生物群落。Alpha多樣性用于評估微生物群落的豐富度和多樣性。ACE和Chao1指數反映物種豐富度，數值越高表明物種數量越多。香農指數和辛普森指數用于評估物種多樣性和均勻度，數值越高表明群落多樣性越高，物種分布越均勻。

對照組的Chao1、ACE、香農和辛普森指數值最高，表明物種豐富度和多樣性最大，反映了PDCF初始細菌群落結構的復雜性。相比之下，EBI顯示出最低的Alpha多樣性指數。等級豐度曲線的結果與此一致：對照組的曲線最平緩，橫軸覆蓋范圍最廣，表明物種分布相對均勻且豐富度高；而EBI的曲線陡峭且橫軸范圍窄，表明群落明顯向極少數分類單元主導轉變。這些存活的微生物可能具有抗輻射性或DNA損傷修復能力。HTST表現出第二低的Alpha多樣性指數，其次是LTLT，而HPP、US和MW引起的群落豐富度和均勻度變化相對較小。

然而，Alpha多樣性的降低并不等同于微生物安全性的提高，特別是當單一分類群成為主導時。相反，維持較高的Alpha多樣性具有雙重含義：它可能通過競爭排斥抑制致病菌，但也可能因容納更多腐敗菌而增加風險。因此，對多樣性的解讀應結合微生物負荷和特定群落組成的考量。隨后的群落結構分析識別了各組中殘留的和差異豐度的細菌屬，為安全性評估提供了全面基礎。

主坐標分析（PCoA）用于評估Beta多樣性，它反映了不同處理的脫骨雞爪樣品中微生物群落的結構差異。在PCoA圖中，距離較近的樣品在物種組成上更相似，而距離越大則表明差異越明顯。如圖所示，所有減菌處理都導致與對照組明顯分離，證實處理顯著改變了原始細菌群落。此外，不同減菌處理之間也存在明顯的分離，表明技術對細菌群落產生了不同的影響。具體而言，LTLT、MW和US表現出相對相似的細菌群落結構。HPP似乎更接近對照組。需要注意的是，PCoA中觀察到的HPP與對照組群落組成相似性較高，并不等同于微生物安全性改善。相比之下，EBI和HTST形成了獨立的簇，表明它們的微生物結構與其他處理有顯著不同。

本研究分析了不同微生物減菌處理下PDCF從門到屬水平的細菌群落組成。共鑒定出6個細菌門。厚壁菌門是優勢門，相對豐度在對照組為46.82%，EBI組為99.86%，US組為42.86%，HPP組為44.73%，HTST組為99.97%，LTLT組為95.11%，MW組為35.58%。變形菌門是第二優勢門。變形菌門和厚壁菌門都被廣泛報道為包括魚、雞和貝類在內的各種肉制品中的主要腐敗微生物區系。結果表明，EBI、LTLT和HTST降低了變形菌門的相對豐度，同時保留了高比例的厚壁菌門，表明對變形菌門有更強的抑制作用。

圖7B描述了不同處理后PDCF中前10位細菌屬的相對豐度。對照組的微生物群落主要由腸桿菌屬、庫爾特氏菌屬、漫游球菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬組成。所有處理都顯著改變了微生物組成。EBI處理后，細菌群落幾乎完全由葡萄球菌屬（99.43%）主導，表明可能存在耐輻照菌株。US、HPP和MW都降低了腸桿菌屬和庫爾特氏菌屬的相對豐度，但它們富集了不同的屬：US富集了鏈球菌屬和不動桿菌屬，HPP富集了乳球菌屬，MW富集了乳球菌屬、鏈球菌屬和不動桿菌屬。在熱處理中，HTST導致芽孢桿菌屬絕對優勢，而LTLT主要富集了腸球菌屬和類芽孢桿菌屬，這表明耐熱菌的選擇因溫度而異。總之，微生物減菌處理不僅決定了微生物減少的效率，更關鍵的是塑造了殘留細菌群落的組成。

本研究使用線性判別分析效應量（LEfSe），以LDA得分大于4.5且p值小于0.05為標準，識別了不同處理間表現出顯著差異的細菌分類單元，并生成了分支圖。在分支圖中，相同顏色的節點代表組間無顯著差異的系統發育分類單元，而不同顏色的節點則表示在其對應處理組中顯著富集的分類單元。節點大小與分類單元的豐度成正比。

在對照組中鑒定的生物標志物包括庫爾特氏菌屬、漫游球菌屬和腸桿菌屬。其中，庫爾特氏菌屬廣泛分布于農場環境、動物糞便和肉制品中，是一種常見的環境微生物，通常不會導致肉類腐敗。漫游球菌屬常見于水生環境，是一種非典型人類病原體，也是已知的魚類腐敗菌。腸桿菌屬既是經典病原體也是腐敗菌，可導致真空包裝肉類的脹袋腐敗。這些屬共同反映了PDCF中典型的環境指示菌和腐敗微生物區系。如圖所示，所有微生物減菌處理都有效抑制了此類微生物群。

每種微生物減菌處理也塑造了獨特的殘留微生物群落。EBI的生物標志物被鑒定為葡萄球菌屬，其中巴氏葡萄球菌是優勢種。作為廣泛分布于食品加工環境中的機會性病原體，該菌的某些菌株可分泌脂肪酶或蛋白酶，從而對食品構成潛在的腐敗風險。在US中，特征性分類單元是鏈球菌屬和摩根氏菌屬。鏈球菌屬包含幾個被認為是潛在病原體的物種，例如已知會引起腹瀉等臨床癥狀的路特鏈球菌。摩根氏菌屬是一種機會性病原體。HPP的特征性分類單元是乳球菌屬和氣單胞菌屬。盡管乳球菌被公認為安全（GRAS）并廣泛用于食品發酵和防腐，但它也被確定為雞肉中的主要腐敗菌。此外，文獻中偶有報道某些物種在極少數情況下可能表現出潛在的致病性。氣單胞菌是冷藏肉制品中另一種典型的腐敗菌，其某些菌株也表現出致病特性。

在熱處理中，HTST主要富集了芽孢桿菌屬，而LTLT則以腸球菌屬和類芽孢桿菌屬為主。HTST中的芽孢桿菌種群主要由蠟樣芽孢桿菌組成，它具有腐敗和致病能力，可導致食物中毒。腸球菌是一種機會性病原體，在LTLT中主要由屎腸球菌代表。類芽孢桿菌主要是一種環境微生物，關于其致病性或腐敗活性的報道有限。MW的特征性分類單元是不動桿菌屬，它也是一種機會性病原體，已被認為是真空包裝熟肉制品中的優勢腐敗菌屬。

對TVC和細菌群落的綜合分析揭示了各種微生物減菌處理對PDCF微生物安全性的顯著不同影響。EBI導致最低的TVC和Alpha多樣性；然而，其殘留的微生物群落結構高度同質，幾乎完全由葡萄球菌屬主導，該屬包含已知的潛在致病和腐敗菌株。這進一步表明，Alpha多樣性的降低并不一定意味著微生物安全性的提高，特別是當殘留群落由特定分類單元主導時。同樣，LTLT和HTST導致潛在危險菌屬的大量富集；例如，芽孢桿菌在HTST中占群落比例高達93.86%，且處理后TVC仍保持在較高水平。US和MW在控制TVC方面效果有限，且其特征菌屬大多與致病潛力相關。

相比之下，HPP在實現低TVC的同時，有效抑制了原有的優勢腐敗菌，且未出現任何單一潛在風險菌屬絕對優勢的情況。其主要差異標志菌屬是乳球菌，同時伴有低豐度的氣單胞菌。需要指出的是，盡管乳球菌常被報道通過產酸和競爭排斥機制抑制其他微生物，但不同菌株在貯藏過程中可能表現出不同的行為，在特定條件下仍可能參與腐敗過程或影響產品貨架期。總體而言，HPP在控制微生物負荷和限制潛在風險菌屬過度增殖方面表現出相對平衡的性能。然而，其長期安全性和對貨架期的具體影響，需要基于未來菌株水平的研究和貯藏實驗進行更全面的評估。

本研究系統評估了六種微生物減菌處理對PDCF品質特征和細菌群落結構的影響。在品質屬性方面，所有處理均顯著降低了TVC，但在保持產品質構和感官品質方面表現出顯著差異。EBI處理達到了最低的TVC，且對產品質構和微觀結構的損傷最小；然而，潛在的輻照異味嚴重影響了感官可接受度。HPP實現了第二低的TVC，保持了適當的剪切力、MFI和微觀結構，并獲得了最高的感官評分。相比之下，熱處理和US導致剪切力顯著下降、微觀結構明顯損傷、質地軟化以及感官品質顯著降低。在細菌群落結構方面，PacBio SMRT全長測序分析揭示，不同處理對微生物群落施加了差異化的選擇壓力。EBI和HTST施加的選擇壓力最強，導致群落結構高度簡化，分別由葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬主導。LTLT主要富集腸球菌屬和類芽孢桿菌屬，US富集鏈球菌屬和摩根氏菌屬，MW富集不動桿菌屬。這些優勢菌屬大多與產品腐敗或潛在致病性相關。相比之下，HPP有效抑制了初始的優勢腐敗菌，且未導致殘留微生物群落被單一具有潛在風險的菌屬絕對主導，其主要生物標志物為乳球菌屬。綜上所述，HPP在確保微生物安全性和保持產品質量之間取得了最佳平衡，是PDCF推薦的減菌方法。雖然HPP的初始投資高于傳統熱處理，但其卓越的品質保持能力顯著提升了其工業可行性，特別是對于PDCF這類高價值、富含膠原蛋白的產品。隨著技術進步和規模化生產，其經濟可行性有望進一步提高。本研究結果不僅為優化PDCF的減菌方案提供了科學依據，也為高膠原肉制品的微生物控制與品質保持奠定了理論基礎。