近日，上海交通大學農業與生物學院劉振華課題組在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）期刊上發表題為"Plastid 2-Oxoglutarate-dependent Dioxygenases Mediate Stereoselective C14β-Hydroxylation in Cardenolide Biosynthesis"的研究論文。本研究以夾竹桃科植物杠柳（Periploca sepium）為研究對象，首次在植物中發現α-酮戊二酸依賴型雙氧化酶介導強心苷生物合成中立體特異性的C14β羥基化反應，為革新強心苷的合成策略奠定了至關重要的酶學基礎。

強心苷是治療心力衰竭的特效天然藥物，其標志性結構特征之一，是甾體母核C14位連接有一個β構型的羥基。然而，在天然的甾體前體中，該位置卻是一個α構型的氫原子。如何高效、精準地引入C14β羥基，一直是化學全合成及化學酶法合成面臨的關鍵瓶頸。

本研究通過多組學關聯分析，首先挖掘到催化強心苷前體孕烯醇酮合成的甾醇側鏈裂解酶PsCYP87N10。隨后，通過與PsCYP87N10的基因表達關聯分析，挖掘出20個潛在的甾體羥基化候選酶，包括13個細胞色素P450酶（CYP）和7個α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶（2OGD）。利用煙草瞬時表達與原核表達體外酶活驗證，發現其中一個候選酶Ps2OGD4具有孕烯醇酮羥基化活性。關鍵的核磁共振（NMR）與單晶衍射分析最終證實，該酶的產物正是14β-羥基孕烯醇酮，從而確證了其全新的C14β羥基化功能，該酶被重新命名為Ps14βPH。進一步的同位素示蹤與植物體內基因沉默實驗，證實了Ps14βPH直接參與杠柳中強心苷的生物合成途徑。

本研究發現，催化強心苷合成起始（側鏈裂解）的PsCYP87N10與催化關鍵步驟（C14β羥基化）的Ps14βPH，在杠柳基因組中存在共線性及緊密連鎖的現象，提示它們可能被協同調控。此外，Ps14βPH含有一段該植物科所特有的質體定位肽，可能引導其進入富含輔因子的植物質體中進行高效反應。系統發育分析顯示，杠柳中的PsCYP87N10與之前在其他植物中報道的同類酶（CYP87A亞家族）分屬不同進化分支。這些證據共同表明，夾竹桃科植物可能獨立進化出了一套全新的酶學工具箱，專門用于合成強心苷這類復雜分子。

該項研究首次鑒定并表征了一類獨特的2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶（2OGD），它能夠特異性催化強心苷生物合成中"卡脖子"的C14β羥基化反應。這項發現不僅為理解植物如何進化出復雜特化代謝途徑提供了范例，更重要的是，為未來通過合成生物學策略，實現高價值強心苷藥物的綠色、高效生物制造，提供了強大且創新的"酶學武器"。

上海交通大學劉振華課題組博士研究生王建華、周玄和助理研究員姬文娟為論文共同第一作者，上海交通大學農業與生物學院、張江高等研究院長聘教軌副教授劉振華為本文通訊作者。上海交通大學劉振華課題組成員卞江虎、張昌建、周弘、單長衡、安寧、黎容池也參與了本項工作，上海交通大學藥學院長聘教軌副教授侯四化和博士后李權哲為本研究的X射線單晶衍射分析提供了重要技術支持。本研究得到國家自然科學基金的資助。

原文鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2525003123