制作合適的基因編輯細(xì)胞模型或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域（如生殖生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)等）或臨床轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域（如細(xì)胞替代治療、精準(zhǔn)基因治療等）是不可或缺的手段和技術(shù)方法。目前CRISPR-Cas9及其拓展工具（堿基編輯器、先導(dǎo)編輯器等）已實(shí)現(xiàn)小片段DNA的高效精確刪除、替換與插入，但千堿基級(jí)大片段DNA敲入效率低、精準(zhǔn)性差的問題，長(zhǎng)期制約著基礎(chǔ)研究與轉(zhuǎn)化應(yīng)用的發(fā)展。大片段基因敲入在構(gòu)建長(zhǎng)片段基因敲入細(xì)胞和模式動(dòng)物模型、制備治療用途的CAR-T細(xì)胞以及賦予細(xì)胞特殊生物性狀（如植物抗病抗逆性）等方面具有不可替代的價(jià)值，因此開發(fā)新型高效精準(zhǔn)的大片段基因敲入工具，成為該領(lǐng)域的重要研究方向。

2025年12月10日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)鮑堅(jiān)強(qiáng)課題組、程臨釗課題組，聯(lián)合南京醫(yī)科大學(xué)王成坤課題組以及山東大學(xué)劉洪彬課題組、張友明課題組在Nature Communications雜志發(fā)表了題為“Efficient high-precision transgene knock-in by Recombinases (Redα/β)-enhanced DNA integration-CRISPR-Cas9 (RED-CRISPR)”的研究論文，報(bào)道了一種基于Redα/β重組酶增強(qiáng)的高效精準(zhǔn)大片段基因敲入RED-CRISPR系統(tǒng)，為解決上述瓶頸提供了創(chuàng)新方案。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-67239-w

Redα/β系統(tǒng)是λ噬菌體中進(jìn)化的一種高效同源重組（HR）系統(tǒng)，該系統(tǒng)由Redα和Redβ兩種重組酶構(gòu)成。其中，Redα是一種外切酶，負(fù)責(zé)沿5’到3’方向消化DNA雙鏈斷裂（DSB）末端形成3’單鏈懸垂結(jié)構(gòu)；Redβ是一種單鏈DNA退火蛋白（SSAP），通過鏈退火或鏈交換促進(jìn)重組過程的完成。

RED-CRISPR系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與優(yōu)化：作者分別設(shè)計(jì)了Cas9-Redα、Cas9-Redβ、Cas9-Redα-Redβ、Redα-Cas9-Redβ融合蛋白以及各類“游離型”Redα + Redβ與Cas9共表達(dá)。在進(jìn)行蛋白間linker與核定位信號(hào)（NLS）等原件優(yōu)化后，于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中進(jìn)行長(zhǎng)片段DNA（＞1 kb）敲入測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Cas9-Redα-Redβ融合蛋白效率最高（相對(duì)于Cas9提升2-5倍），因此將Cas9-Redα-Redβ命名為RED-CRISPR系統(tǒng)。進(jìn)一步聯(lián)用RED-CRISPR + 小分子HDR增強(qiáng)劑 + CTS同源修復(fù)模板，可在細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)＞40%的千堿基級(jí)DNA敲入效率。

RED-CRISPR系統(tǒng)的表征與安全性評(píng)估：

（1）作者通過NGS測(cè)序檢測(cè)不同時(shí)間段的NHEJ（非同源末端連接修復(fù)）與HDR（同源定向修復(fù)）事件比例發(fā)現(xiàn)，RED-CRISPR通過抑制NHEJ的發(fā)生從而提高HDR效率；

（2）與單獨(dú)Cas9相比，RED-CRISPR具有更高的精確性和多等位基因編輯能力，且未造成額外的細(xì)胞毒性；

（3）與已報(bào)道的基因敲入優(yōu)化策略相比，RED-CRISPR的效率與之相當(dāng)或高于這些方法，并且RED-CRISPR能夠與這些方法完好兼容，協(xié)同提升敲入效率。  

（4）基因組范圍脫靶編輯事件分析（GUIDE-seq）與染色質(zhì)易位事件分析（PEM-seq）結(jié)果顯示，RED-CRISPR系統(tǒng)編輯時(shí)脫靶編輯事件和染色質(zhì)易位事件顯著降低，表明RED-CRISPR具有更高的安全性，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

RED-CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用：

（1）大片段基因敲入小鼠模型構(gòu)建。作者首先在小鼠受精卵Actb位點(diǎn)用P2A-EGFP做了一個(gè)reporter KI測(cè)試，結(jié)果顯示RED-CRISPR mRNA組（18.0%）較Cas9 mRNA組（6.9%）顯著提升了EGFP⁺囊胚比例。隨后，作者分別在CaMKII和H11位點(diǎn)進(jìn)行大片段基因敲入以制備大片段KI小鼠模型。以H11位點(diǎn)knock-in一個(gè)8 kb的大片段為例：Cas9 mRNA組出生的41只幼鼠中只有1只是正確的KI（2.44%），而RED-CRISPR mRNA組出生的67只幼鼠中有29只是正確的KI（43.28%）,效率提升了17倍。作者在制備基因敲入小鼠模型時(shí)還將金斯瑞公司Cas9 mRNA、NEB公司Cas9蛋白等改造過的商品化基因編輯酶與RED-CRISPR進(jìn)行了平行比較，結(jié)果均顯示RED-CRISPR mRNA的效率提升和安全性是最高的。

（2）高效CAR-T細(xì)胞制備。作者選擇在T細(xì)胞TRAC位點(diǎn)敲入約2 kb的2A-CAR-pA表達(dá)盒來制備CAR-T細(xì)胞。使用質(zhì)粒形式遞送時(shí)，Cas9組的平均CAR陽性率約為4.7%，RED-CRISPR組提升至11.7%；使用mRNA形式遞送時(shí)，Cas9組的CAR陽性率約為27.7%，RED-CRISPR組提升到44.3%。體外殺傷CD19⁺ NALM-6細(xì)胞時(shí)，在E:T=3:1條件下，Cas9組和RED-CRISPR組制備的CAR-T細(xì)胞都能高效清除NALM-6細(xì)胞，而在1:1和1:3低效靶比條件下，RED-CRISPR生成的CAR-T細(xì)胞殺傷更徹底。安全性：在使用相同TRAC gRNA的條件下，Cas9組檢測(cè)到20個(gè)脫靶事件，RED-CRISPR組只檢測(cè)到1個(gè)脫靶事件，染色體易位總比例也從~1.24%降到~1.00%。

（3）疾病的突變位點(diǎn)糾正。β-地中海貧血/鐮刀型貧血患者體內(nèi)，HBB有＞200種致病突變，分布在3個(gè)外顯子上，很難一一設(shè)計(jì)gRNA和donor。在鐮刀型貧血患者來源的iPS細(xì)胞中，作者設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA切掉HBB外顯子1-3區(qū)域，并用一個(gè)完整的HBB cDNA做“整體替換”（knock-in長(zhǎng)度約為2.2 kb）——這種方式對(duì)大多數(shù)HBB突變都有潛在適用性。結(jié)果顯示，陽性iPS克隆中，致病位點(diǎn)的“Val”被成功改回“Glu”。此外，多能性marker染色結(jié)果顯示，RED-CRISPR編輯后iPS細(xì)胞的多能性未受影響。

綜上所述，RED-CRISPR系統(tǒng)是一種高效精準(zhǔn)的大片段基因敲入方法，在大片段基因敲入動(dòng)物模型構(gòu)建、CAR-T免疫療法以及病源突變位點(diǎn)校正等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

鮑堅(jiān)強(qiáng)研究員、王成坤教授、程臨釗教授、劉洪彬教授和張友明教授為本文的共同通訊作者。本研究得到了中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部史慶華教授、薛天教授、合肥星眸生物科技有限公司才源博士、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心岳挺博士、斯坦福大學(xué)叢樂教授以及賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司的大力支持與幫助。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、合肥綜合性國(guó)家科學(xué)中心大健康研究院和安徽省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。

另外，2026年1月23日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)鮑堅(jiān)強(qiáng)課題組與南京醫(yī)科大學(xué)王成坤課題組在Nucleic Acids Research雜志發(fā)表了題為“Compact bacterial recombination complexes drive efficient kilobase-scale knock-in in mammalian cells”的研究論文，報(bào)道了另一種基于RecE/T介導(dǎo)的千堿基級(jí)DNA敲入技術(shù)。原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag020

與Redα/β 系統(tǒng)相似，RecE/T系統(tǒng)是Rac原噬菌體中一種高效同源重組系統(tǒng)，其包括RecE和RecT兩個(gè)蛋白，其中RecE為外切酶，RecT是單鏈DNA退火蛋白。RecE/T系統(tǒng)與Redα/β系統(tǒng)具有相似的同源重組機(jī)制。

在該項(xiàng)研究中，作者篩選到EcRecE可作為一種高效的HDR增強(qiáng)因子，評(píng)估了Cas9/EcRecE偶聯(lián)系統(tǒng)在不同細(xì)胞系和原代細(xì)胞中的HDR增強(qiáng)能力，并對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化和安全性評(píng)估。結(jié)果顯示：EcRecE可將各類細(xì)胞中的HDR效率提高2-4倍，并且與單獨(dú)使用Cas9相比具有更高的精準(zhǔn)性。作者隨后結(jié)合蛋白質(zhì)工程獲得了尺寸最短但效率最高的RecE變體。結(jié)合課題組之前開發(fā)的REDIT和dCas9-SSAP技術(shù)（Wang et al., 2021,Nucleic Acids Research; Wang et al., 2022, Nature cell biology），作者將截短的RecE與RecT融合，分別構(gòu)建了Cas9-miniRecE/T、Cas9n-miniRecE/T和dCas9-miniRecE/T系統(tǒng)。結(jié)果表明，這些系統(tǒng)均可在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效大片段基因敲入。其中，dCas9-miniRecE/T系統(tǒng)能夠在不形成DNA單鏈/雙鏈斷裂的條件下實(shí)現(xiàn)高于野生型Cas9的基因敲入效率，這對(duì)于精準(zhǔn)基因治療具有重要意義。最后，作者將miniRecE/T系統(tǒng)應(yīng)用于人類胚胎干細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元。另外，由于miniRecE/T尺寸很小，作者將其與Cas9一起包裝到腺病毒，并在多個(gè)細(xì)胞內(nèi)源性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效大片段DNA敲入。

鮑堅(jiān)強(qiáng)研究員、王成坤教授和韓峰教授為本文的共同通訊作者。本研究得到了斯坦福大學(xué)叢樂教授的支持與幫助。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、合肥綜合性國(guó)家科學(xué)中心大健康研究院和安徽省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。