研究所用的鋁片購自Conrad Electronic（德國）。其他化學品，如氫氧化銨（NH₄OH）、過氧化氫（H₂O₂）、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、山羊抗人IgG、IgM和IgA-HRP、硫酸（H₂SO₄）購自Sigma-Aldrich。乙醇和甲苯購自Biosolve。磷酸鹽緩沖鹽水購自PanReac AppliChem。Tween 20購自Fisher Chemical。3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（TMB）和抗人IgA/IgM/IgG-FITC購自Invitrogen, Thermo Fisher Scientific。Costar 96孔板購自Corning Inc.。本研究使用的重組蛋白（序列：LTPLSTTSGGKGKPTPNSTASVGKGKSNTPVASSGGKGKSSRIDLTVAGKGKVSTPTGSTA）在實驗室中表達和純化，該構建體源自本課題組先前描述的肽段，這些肽段在ELISA中與麻風病接觸者血清顯示出有前景的反應性。

本研究中納入了來自巴西個體的血清樣本，樣本來源于寄生蟲免疫生物學與控制實驗室（LICP-UFMG）的生物樣本庫。所有參與者均匿名，并在樣本采集前提供了書面知情同意。麻風病接觸者的定義基于其指示病例（索引病例）的麻風病診斷，該診斷由各自醫療機構的專科醫生根據世界衛生組織（WHO）的操作分類進行：多菌型（MB）和少菌型（PB）。結核病基于臨床標準診斷。研究方案經米納斯吉拉斯聯邦大學倫理委員會批準，并根據巴西國家衛生委員會的指導方針進行。本研究使用了七份麻風病接觸者（暴露于麻風分枝桿菌）、六份陰性對照（未暴露）和一份結核病患者的血清樣本。

采用常規ELISA檢測針對設計蛋白的特異性免疫球蛋白。血清樣本按1:400、1:200、1:133、1:100和1:80稀釋于含0.5% BSA的PBS中進行檢測。使用辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗人IgA、IgM和IgG（在含0.5% BSA的PBS中稀釋1:10,000）作為二抗。實驗按照先前描述的方案進行，使用TMB作為底物，并在450 nm波長下讀取光密度值。

將鋁片切割成芯片（1 × 1 cm，厚度0.5 mm）。首先將芯片浸入堿食人魚溶液（NH₄OH:H₂O₂, 3:1, 20%）中攪拌45分鐘，以生成羥基化表面。隨后，用乙醇和去離子水徹底沖洗芯片各三次，并用氮氣流干燥。硅烷化過程采用甲苯中2%的APTES在70°C氣相條件下進行60分鐘，隨后在熱板上干燥1分鐘，再用氮氣流干燥。芯片接著用50%戊二醛（pH 7.4）在室溫下處理15分鐘，然后用去離子水徹底沖洗。通過將芯片浸入10 μg/mL蛋白質溶液（溶于PBS）中60分鐘來實現蛋白質固定，隨后用PBS-T（含0.05% Tween 20的PBS）洗滌。為了阻斷非特異性結合，芯片在含5% BSA的PBS中孵育，然后從封閉液中取出，轉移至HTM流動池或用于后續的ELISA或共聚焦顯微鏡分析。

使用配備衰減全反射（ATR）晶體的光譜儀在吸收模式下獲取鋁表面的FTIR光譜。測量參數：光譜分辨率16 cm^?1，掃描200次，Happ-Genzel切趾函數，波數范圍400?4000 cm^?1。

使用配備EDX探測器的場發射掃描電子顯微鏡分析鋁表面的元素組成。測量在二次電子檢測（SED）模式下進行，著陸電壓10.0 kV，工作距離10.0 mm，高真空下放大倍率×2000。加速電壓設為10.0 kV，活時間100.00秒，實時間101.46秒。死時間保持在1.0%，計數率為每秒3959次計數。使用標準無ZAF方法對數據進行量化。

生物功能化后，為確認功能性蛋白質結合，將芯片與用0.5% BSA（PBS中）稀釋1:100的人血清樣本，或僅含0.5% BSA的對照液，在37°C下孵育60分鐘。隨后用PBS-T洗滌并加入二抗。

對于ELISA類似法，應用山羊抗人IgA、IgM和IgG-HRP二抗（在0.5% BSA中稀釋1:10,000）于37°C孵育60分鐘。PBS-T洗滌后，加入TMB底物，室溫避光孵育15分鐘。加入1 M H₂SO₄終止反應，并使用紫外-可見分光光度計測量液體在450 nm處的吸光度。

對于共聚焦顯微鏡，芯片與抗人IgA/IgM/IgG-FITC二抗（在0.5% BSA中稀釋1:15,000）在4°C下孵育過夜。使用配備蔡司Axiocam 705單色相機的蔡司Axio Observer 7倒置顯微鏡進行熒光成像。使用5倍/0.16 NA EC Plan-Neofluar空氣物鏡，像素分辨率為0.69 × 0.69 μm。用469 nm LED（20%強度）激發FITC標記的抗體，通過四波段帶通濾光片收集發射光。圖像曝光時間為150毫秒，并使用ImageJ（Fiji）處理。

生物傳感器的配置如前所述。簡言之，將生物功能化的鋁芯片安裝在銅塊熱源上，受體層面向流動池。銅塊溫度通過K型熱電偶持續監測，并通過由功率電阻器和基于LabVIEW軟件的比例-積分-微分（PID）控制器組成的溫控系統維持在37°C。流動池內液相溫度由位于識別層上方1 mm處的第二個K型熱電偶測量。聚碳酸酯流動池的內部容積為110 μL，功能化芯片與密封O型圈之間的接觸面積為28 mm²。通過注射泵控制含目標抗體的血清樣本注入裝置。首先用0.5% BSA對流動池進行條件化，并使系統平衡30分鐘。為了捕獲對應于芯片上抗體結合逐步增加的熱響應，每個血清樣本以五個連續注射周期引入流動池。樣本初始稀釋度為1:400，每個周期包括5分鐘的注入和20分鐘的熱穩定。每個周期后，注入相同稀釋度（1:400）的新等分試樣血清，置換流動池中的先前內容，從而有效增加受體層上目標物保留的累積濃度。經過五個周期，有效的血清稀釋度分別約為1:400、1:200、1:133、1:100和1:80。在整個測量過程中，溫度被持續監測。使用配備風扇的隔離箱來維持測量環境的穩定溫度，并確保流動池內觀察到的溫度變化不受周圍環境波動的影響。

使用Origin 2025和GraphPad Prism 10進行統計分析。計算效應量以評估組間觀察到的差異大小。閾值由平均值加三倍標準差確定。對于每次添加，計算穩定后的溫度平均值，并計算效應量以反映相對于基線的百分比變化。所有測量均進行獨立的三次重復實驗。還包含了僅含BSA的對照以評估背景信號。

ELISA結果顯示，在測試樣本中，針對該蛋白的特異性IgG、IgA和IgM均存在，并且這些免疫球蛋白的水平隨著血清濃度增加而升高。接觸者血清樣本僅在確認指示病例診斷后采集，表明采樣前暴露于麻風分枝桿菌可能已持續相當長時間。由于與其他免疫球蛋白類別相比，血清IgA反應通常是早期且短暫的，因此在此階段IgA水平可能已經下降。因此，盡管生物學差異可能仍然存在并應予以考慮，但組間對于該免疫球蛋白可能未觀察到統計學上的顯著差異。接觸者中觀察到顯著高于陰性對照的IgM和IgG水平，這與先前研究的結果一致。這些結果證實了該隊列中存在針對該抗原的多種免疫球蛋白類別。

通過FTIR、ELISA類似法和共聚焦熒光成像對生物功能化芯片進行了表征。FTIR光譜顯示裸鋁表面與生物功能化表面存在差異。生物功能化后，表面在~3400 cm^?1附近出現寬譜帶，對應O?H伸縮振動，表明活化后表面存在羥基。在~2970 cm^?1和~2880 cm^?1處出現新的吸收譜帶，對應C?H伸縮振動，以及在~1630 cm^?1、~1560 cm^?1和~1300 cm^?1處出現強譜帶，分別屬于酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶振動。這些光譜變化表明蛋白質分子存在于表面，確認了生物功能化成功。通過EDX進一步評估功能化，揭示了裸表面與生物功能化表面之間的元素差異。

在類似條件下進行兩種互補測定以直觀確認生物功能化成功，并評估平臺上重組蛋白以其生物學功能形式存在的情況：ELISA類似法和共聚焦熒光成像。兩種測定均比較了與陰性對照孵育的生物功能化芯片，以及與之前顯示能識別固定蛋白抗體的人血清孵育的芯片。

對于ELISA類似法，與陰性對照血清孵育的芯片在450 nm處的吸光度分別為：IgA 0.190，IgM 0.199，IgG 0.193；而與麻風病接觸者血清孵育的芯片顯示出更高的平均吸光度值，分別為0.284、0.296和0.305，表明抗體結合增加。在熒光測定中，麻風病接觸者樣本觀察到的信號約為陰性對照的兩倍，平均強度值分別為20,741和9830，表明抗體與功能化表面的結合增加。這些結果表明蛋白質已成功固定在芯片上，并保留了結合人樣本中抗體的能力，證明相關表位在固定后仍可及。此外，它們證實了除IgG外，其他免疫球蛋白類別也能與蛋白質結合并可同時被檢測。

使用材料與方法部分描述的微流體流動池中的熱傳導方法，評估了所得功能化芯片定量人血清中抗麻風分枝桿菌抗體的能力。首先使用0.5% BSA溶液填充微流體室并使系統達到平衡溫度，以建立定量實驗的基線。隨后用0.5% BSA中稀釋1:400制備的人血清樣本替換緩沖液。重復注入過程，并使用位于芯片上合成受體上方的熱電偶實時監測溫度。

研究顯示了當蛋白質（合成受體）包被的芯片暴露于與麻風病患者密切接觸者血清和未接觸者血清時，觀察到的代表性原始溫度信號。對于暴露于麻風分枝桿菌的樣本，溫度隨時間下降更為明顯，這與抗麻風分枝桿菌抗體與固定蛋白質的特異性結合一致。結合后，目標抗體抑制了從銅塊到腔內液體的熱流。使用在先前ELISA中光密度值低于和高于閾值的未暴露和已暴露樣本來構建校準曲線。結果表明，當合成受體與暴露于麻風分枝桿菌樣本中存在的目標抗體相互作用時，傳感器的響應更好。暴露樣本在最終添加時產生的效應量是未暴露樣本的四倍，證實了觀察到的響應可歸因于固定蛋白質和血清中特異性抗體的存在。相比之下，未暴露樣本的響應接近傳感器噪聲水平，表明芯片上抗體結合極少或無法檢測到。在第五次注入稀釋血清后，所有樣本的信號均略有增加，這可能是由于其他血清成分的非特異性沉積。

使用一份結核病患者的人血清樣本來評估受體層的選擇性。結果顯示，該裝置對暴露于麻風分枝桿菌的血清的效應量約為結核病樣本的三倍。這種顯著差異可歸因于特異性抗體識別的基本機制，該機制依賴于分析物與固定受體之間的生化相互作用。與校準類似，結核病血清產生的響應接近傳感器噪聲，在第五次注入后信號增加，這強化了抗體與芯片結合極少或沒有的觀點，并表明后期信號是由于更高濃度下血清成分的非特異性沉積。

鑒于測試血清樣本中針對該新型蛋白的抗體濃度未知，研究的主要目標是確定是否存在能夠與固定蛋白質結合的抗體。在傳染病診斷背景下，定性檢測最為相關，因為確認特異性抗體的存在足以指示病原體暴露并指導治療和公共衛生政策。為此，將五個陰性對照樣本的平均信號加上三倍標準差設定為陽性閾值。用傳感器測試了六名不同麻風病患者密切接觸者的樣本。信號高于閾值的被歸類為陽性，低于閾值的被歸類為陰性。

結果顯示，校準和選擇性測試后測試的額外暴露樣本在第二次或第四次注射后超過了閾值。這在先前分類為MB或PB接觸者的樣本中均有觀察到，表明即使在高于其他麻風病ELISA檢測中使用的血清稀釋度下也能產生陽性響應。這表明，盡管抗體與通常用熱傳導方法測試的較大病原體相比尺寸較小，但基于熱傳導的生物傳感器可以在與ELISA相當甚至更低的血清稀釋度下檢測到特異性抗體結合。這種性能可能與傳感器的無標記特性有關，該特性允許同時檢測結合到表面的多種免疫球蛋白類別，這一點得到了常規ELISA、ELISA類似法和共聚焦熒光結果的支持。相比之下，僅含BSA的測量值保持在傳感器噪聲水平以下，確認了基質對熱傳導信號的貢獻可忽略不計。值得注意的是，抗麻風分枝桿菌抗體水平通常非常低，這證明我們的平臺足夠靈敏，能夠檢測到微量的抗體。盡管抗體數量對于治療或控制措施并非臨床決定性因素，但分析靈敏度對于在低抗體滴度樣本中區分真實的結合事件至關重要，從而降低假陰性反應的可能性。這一觀察結果也表明，對于循環抗體水平通常較高的疾病，例如利什曼病或蟲媒病毒感染，該平臺的分析性能可能會進一步增強。

綜合來看，研究結果表明HTM有潛力以無標記方式同時檢測不同的免疫球蛋白類別，從而能夠開發泛Ig檢測策略，這可能比ELISA等其他血清學測試成本更低、步驟更少。這種檢測策略尤其重要，因為在暴露于麻風分枝桿菌后，抗體反應逐漸且異質地發展，不同的免疫球蛋白類別可能在臨床疾病發作前的不同時間點變得可檢測。有證據表明，IgM與IgG和/或IgA聯合檢測呈陽性的接觸者感染和疾病進展的風險更高，這強調了在接觸者監測中進行泛免疫球蛋白篩查的重要性。個體間抗體水平的差異可能反映了暴露持續時間、宿主免疫反應或自初始感染以來時間的差異。此外，先前研究表明，MB患者的接觸者往往呈現更高的抗體負荷，這與我們觀察到的趨勢一致。由于每個血清樣本來自單個接觸者，根據其指示患者分類，同一份樣本內同時存在PB和MB抗體反應的情況并不預期。目前，巴西使用基于酚糖脂-I（PGL-I）抗原的血清學檢測進行接觸者追蹤。然而，根據制造商信息，其臨床驗證是針對患者而非接觸者進行的。有證據表明，一些在該血清學檢測中呈陰性的接觸者仍然表現出未暴露個體中未觀察到的細微感覺改變，這表明該血清學工具可能不足以進行有效的接觸者監測。在此背景下，需要新的策略來提高檢測準確性，例如本研究提出的方法。一些作者建議對發病風險最高的個體（如接觸者，包括兒童）進行預防性干預。

此外，研究結果表明，暴露于麻風分枝桿菌可能不僅限于與確診患者直接接觸的個體。關于人畜共患傳播（尤其涉及犰狳）的報告表明，接觸這些潛在宿主的個體也可能面臨風險，但通過常規的指示病例追蹤仍無法檢測到。檢測無癥狀個體中抗麻風分枝桿菌抗體的另一個潛在應用是識別來自流行地區的感染者，特別是獻血者中的識別。雖然本研究未直接評估此應用，但在臨床健康個體中進行血清學抗體檢測可能有助于識別無癥狀攜帶者，并降低通過血液傳播等途徑傳播的風險。

將麻風病接觸史、潛在非人類宿主暴露情況，以及可行的敏感血清學檢測整合到監測方案中，可以顯著加強疾病控制工作，這與世界衛生組織到2030年阻斷傳播的目標相一致。因此，在癥狀出現前檢測麻風分枝桿菌感染仍然是麻風病的關鍵診斷挑戰之一。本研究開發的生物傳感器顯示出解決這一診斷空白的巨大潛力，但將其轉化為實際應用需要進一步優化傳感層和電子信號處理、大規模驗證以及設備小型化，以便集成到即時檢測平臺中。

本研究成功開發了一種基于熱傳導的無標記生物傳感器，該傳感器采用新型多表位蛋白功能化，能夠直接在人血清樣本（相比緩沖液更具挑戰性的基質）中檢測抗麻風分枝桿菌抗體。未來的研究應優先對檢測呈陽性的個體進行縱向隨訪，以評估健康結果并識別早期臨床體征，從而闡明該方法的預測價值。將生物傳感器信號與生物樣本中的麻風分枝桿菌DNA水平相關聯，可能進一步闡明抗體檢測與細菌負荷之間的關系，從而加強診斷準確性。除了麻風病，該生物傳感器平臺有望適應于其他傳染病，為早期診斷和流行病學監測提供多功能解決方案。總之，這些策略可以改變早期檢測方式，支持預防性干預，并加強全球疾病控制工作。