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本文作者針對標準CRISPRko或CRISPRi方法在實現功能缺失效應時存在的速度、效能與sgRNA間變異性問題，介紹了一種名為CRISPRgenee的新型雙向導RNA系統。該系統通過同時進行基因敲除與表觀遺傳學沉默，協同增強了功能缺失效應，加速了基因耗竭，并降低了sgRNA間的變異性，從而為針對困難靶點的高分辨率遺傳篩選提供了更強大的工具。
在當今的生命科學研究中，精確地“關閉”特定基因以研究其功能（即實現功能缺失），是揭示基因奧秘、探索疾病機制的關鍵步驟。科學家們早已裝備了強大的工具——CRISPR-Cas9系統。通過設計特定的向導RNA（sgRNA），Cas9蛋白便能像一把分子剪刀，在基因組特定位置進行切割，進而導致基因失活，這種方法被稱為CRISPR基因敲除（CRISPRko）。另一種策略則更為“溫和”，它不切割DNA，而是利用失活的Cas9蛋白（dCas9）融合表觀遺傳修飾器，靶向基因啟動子區域并沉積抑制性標記（如甲基化），從而在表觀遺傳層面使基因“沉默”，這種方法稱為CRISPR干擾（CRISPRi）。然而，無論是“硬砍伐”的CRISPRko還是“軟封印”的CRISPRi，都各有其局限。CRISPRko雖然徹底，但其編輯效率和對細胞的影響可能因不同的sgRNA設計而有顯著差異（即sgRNA變異性高），且對于一些難以編輯或需要快速看到表型的“困難靶點”，效果可能不夠理想或不夠迅速。CRISPRi雖然可逆且特異性高，但其沉默效果有時不夠強或不夠持久。那么，能否創造一種“雙管齊下”的策略，結合兩者的優勢，更快、更強、更穩定地實現基因功能缺失呢？
為了回答這個問題，研究人員開發并報道了一種名為CRISPRgenee的創新系統。該系統本質上是一種雙向導RNA（dual-guide RNA）策略，它巧妙地同時募集了具有切割活性的Cas9核酸酶以實現基因敲除（KO），以及融合了表觀沉默結構域的dCas9蛋白以實現表觀遺傳干擾（i），從而對目標基因實施協同攻擊。研究結果表明，這種雙重作用策略顯著增強了功能缺失效應，加速了目標基因產物的耗竭過程，并且與使用單一sgRNA的標準CRISPRko或CRISPRi方法相比，有效降低了不同sgRNA之間的性能變異性。這意味著，CRISPRgenee系統能夠提供更可靠、更高效的基因擾動工具，極大地擴展了在高分辨率遺傳篩選，尤其是針對那些傳統方法效果不佳的挑戰性靶點時的能力。這項研究已發表在專業期刊《BIOspektrum》上。
在技術方法層面，本研究主要基于分子克隆技術構建了CRISPRgenee系統的核心載體，該系統設計為可同時表達靶向同一基因不同功能區域的兩條sgRNA。關鍵的實驗技術包括：利用慢病毒包裝系統產生能夠穩定表達CRISPRgenee組分的細胞系；通過流式細胞術或熒光成像定量評估目標基因敲除與沉默的效率和動力學；以及應用深度測序（如RNA-seq）在全基因組范圍驗證系統的特異性和評估sgRNA的變異性。研究通過對比實驗，將CRISPRgenee系統與傳統的單一CRISPRko、CRISPRi以及兩者簡單聯用的效果進行了系統比較。
研究結果
雙重作用機制的設計與驗證
研究人員首先從概念上設計了CRISPRgenee系統，其核心在于使用一對sgRNA分別引導具有切割活性的Cas9和融合了表觀沉默結構域（如KRAB）的dCas9，同時作用于目標基因。通過報告基因系統和內源基因檢測，他們證實了該系統能夠成功地在一個細胞中同時實現DNA切割（導致移碼突變或缺失）和轉錄起始位點附近的表觀遺傳沉默標記沉積。
增強的功能缺失效應與加速的基因耗竭
在多個不同細胞系和靶基因的測試中，CRISPRgenee系統展現出比單獨使用CRISPRko或CRISPRi更強的功能抑制效果。定量數據顯示，目標蛋白的下調速度更快，最終達到的敲低/敲除水平更深。這表明基因敲除與表觀沉默產生了協同效應，而非簡單疊加。
降低的sgRNA間變異性
通過對一系列靶向同一基因的不同sgRNA進行平行測試，研究人員發現，采用CRISPRgenee雙sgRNA策略時，不同sgRNA組合所導致的功能缺失效果之間的差異（變異性）顯著低于單獨使用任一sgRNA進行CRISPRko或CRISPRi時的變異性。這提高了遺傳篩選結果的可靠性和可重復性。
在高分辨率遺傳篩選中應用的潛力
作為概念驗證，研究將CRISPRgenee系統應用于一個模型遺傳篩選場景。結果顯示，該系統能夠更清晰地區分必需基因和非必需基因，并且對于某些用傳統方法信號微弱的“困難”靶點，也能產生強而可檢測的表型信號，證明了其在復雜功能基因組學研究中的實用價值。
結論與討論
本研究的核心結論是，CRISPRgenee作為一種整合了基因敲除與表觀沉默雙重機制的雙向導RNA系統，提供了一種優于傳統單一策略的強大工具。它通過協同作用，實現了更快速、更深刻且更穩定的基因功能缺失效果，同時顯著降低了因sgRNA設計不同而帶來的技術變異性。
其重要意義主要體現在以下幾個方面：首先，在方法論上，它突破了現有CRISPR工具的功能邊界，為功能基因組學研究提供了新的、效力更強的“武器”。其次，在應用層面，它特別有利于針對那些對單一擾動策略不敏感、或需要快速產生強表型的“挑戰性靶點”（如某些轉錄因子、冗余基因家族成員等）進行高置信度的遺傳篩選和功能解析。這有助于發現新的藥物靶點或疾病相關基因。最后，降低的sgRNA變異性意味著在大型篩選實驗中，數據的信噪比更高，解讀更可靠，可以減少驗證實驗的工作量并節約研究成本。盡管該系統可能需要更復雜的載體設計和優化，但其帶來的效能提升使其在基礎研究和轉化醫學中具有廣闊的應用前景。未來的工作可以進一步探索其在不同細胞類型、體內模型以及針對特定疾病通路中的應用效能。
