姜黃素類化合物，包括姜黃素（CUR）和去甲氧基姜黃素（DMC），以其抗病毒特性而聞名，但其潛在的抗病毒靶點尚不清楚，與I型干擾素（IFN-I）信號通路的關系也未被完全闡明。本研究探索了DMC和CUR在EV-D68感染小鼠模型中對IFN-I通路的調節作用，并采用多組學分析來識別關鍵藥物靶點及其相互作用網絡。研究發現，DMC在光、溫度和pH變化下表現出比CUR更好的理化穩定性。在體外和新生小鼠模型中，DMC和CUR通過抑制病毒2A基因表達和促炎細胞因子的釋放，有效抑制了EV-D68的復制。這兩種化合物都能上調分子伴侶CRYAB，CRYAB在EV-D68感染期間轉位到細胞核，并作為宿主代謝和抗病毒免疫的中心調節因子。進一步的多組學分析表明，CRYAB過表達抑制了嘌呤代謝并上調了干擾素刺激基因（ISGs）。蛋白質組學分析將RBM26鑒定為關鍵的CRYAB相互作用靶點。CRYAB通過抑制病毒誘導的泛素化來穩定RBM26，從而增強IFN-I反應。DMC和CUR通過RBM26激活mtDNA-cGAS-STING通路，刺激下游信號傳導和抗病毒效應。RBM26重構改變了胞苷/尿苷單磷酸激酶2（CMPK2）的剪接，導致核苷酸周轉增加和胞苷水平降低，從而損害病毒復制。DMC/CUR處理或CRYAB過表達同樣降低了細胞內胞苷和尿苷水平，增強了抗病毒活性。此外，DMC/CUR以RBM26依賴的方式恢復了EV-D68感染抑制的mtDNA水平，刺激cGAS介導的cGAMP產生，并激活STING-TBK1-IRF3軸。這些發現不僅闡明了姜黃素類化合物抗病毒作用的分子機制，也突出了其作為宿主導向抗病毒藥物的治療潛力。

姜黃是南亞和中東菜肴中的傳統香料和著色劑，含有姜黃素類化合物，如姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素。姜黃素具有廣泛的治療潛力和多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和神經保護作用。先前，我們使用透明質酸修飾的姜黃素基納米藥物來促進糖尿病傷口愈合。據報道，CUR通過抑制復制或破壞病毒-宿主相互作用來抑制多種病毒感染，但其水溶性差和pH不穩定性導致其快速降解為無活性產物。DMC同樣具有廣泛的藥理潛力，包括抗高血壓、抗瘧疾、抗病毒和抗菌作用。由于其芳香環上缺少一個甲氧基，DMC在室溫下的水溶性更高，并且在生理條件下比CUR表現出更高的穩定性和生物活性。然而，DMC保留了CUR的主鏈結構，并對多種病毒表現出抗病毒活性，包括抑制病毒包膜糖蛋白的構象變化，這些變化有助于病毒附著到宿主細胞膜。

先前的研究表明，DMC顯著增強I型干擾素（IFN-I）反應并上調干擾素刺激基因（ISGs）的表達。同樣，另一項研究證明CUR可以增強I型IFN反應。然而，這是否代表了CUR和DMC共有的共同抗病毒機制尚不清楚。闡明這些潛在機制對于推進姜黃素類藥物的臨床開發和拓寬其在生物醫學研究中的潛在應用至關重要。腸道病毒D68（EV-D68）是小核糖核酸病毒科的成員，是一種無包膜的正鏈單鏈RNA病毒。EV-D68主要引起呼吸道疾病，特別是在免疫功能低下的人群中，如兒童和老年人。此外，感染可導致神經系統并發癥，包括急性弛緩性脊髓炎，其早期癥狀通常包括頭痛、頸部及背部僵硬或疼痛。在更嚴重的情況下，病情可能發展為神經功能障礙和肌肉無力。目前，尚無批準的針對EV-D68感染的抗病毒療法或疫苗。

因此，本研究采用比較分析來評估它們的理化特性和不同的細胞反應。利用蛋白質組學分析和分子對接來識別與CUR和DMC抗病毒活性相關的中心樞紐靶點。建立了由這些靶點調控的蛋白質庫，并進一步整合代謝組學分析來描繪兩種化合物調控的共同代謝途徑。在綜合的藥物-靶點-代謝途徑網絡基礎上，本研究闡明了姜黃素類化合物在病毒感染期間調控宿主代謝重編程的機制。這些發現為理解姜黃素類化合物與宿主抗病毒反應之間的相互作用提供了新的見解，彌補了關于基于天然產物的宿主靶向通路調控對抗RNA病毒感染的知識空白。

通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對CUR和DMC的結構特征進行了分析。結果表明，DMC的光譜缺少CUR中觀察到的幾個特征吸收峰，特別是在1150.6、1105.5和1423.4 cm^-1處。這是因為與DMC相比，CUR的苯環上多了一個-OCH₃基團，這產生了CUR中觀察到的特征吸收峰，特別是在1150.6 cm^-1（CUR中-OCH₃的C-O伸縮振動）、1105.5 cm^-1（CUR中苯環的C-O伸縮振動）和1423.4 cm^-1（CUR中-OCH₃的C-H彎曲振動）。接下來，評估了兩種化合物在不同環境條件下的穩定性，包括不同溫度、光照時間和pH值。與CUR相比，DMC表現出顯著更高的穩定性，在長時間光照（>50分鐘）、強酸性（pH<3）和堿性（pH>8）條件以及溫度超過30°C時表現出更好的抗降解能力。這些結果表明，DMC在極端條件下比CUR更穩定。

為了進一步研究CUR和DMC的抗病毒活性，我們使用出生24小時內感染EV-D68的新生BALB/c小鼠模型。根據麻痹評分和存活率，DMC即使在低劑量下也表現出有效的抗病毒活性，且具有劑量非依賴性保護作用，而CUR僅在高劑量下顯示出顯著的抗病毒效果。體重分析顯示，與對照組相比，EV-D68感染導致感染小鼠生長顯著遲緩。DMC和CUR治療均有效緩解了病毒感染引起的生長抑制，盡管CUR需要比DMC更高的有效濃度。腦、肺和肝組織的組織學分析顯示，CUR（HD）和DMC（MD）組炎癥減輕，且DMC（MD）效果更顯著。值得注意的是，大腦和肺部的炎癥比肝臟和脾臟更明顯。因此，我們評估了腦和肺組織中促炎細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平。在同等藥物濃度下，只有DMC顯著降低了細胞因子水平，而CUR輕微降低了細胞因子水平。

EV-D68 2A蛋白與宿主細胞翻譯機制相互作用以促進病毒基因組復制。因此，我們通過RT-qPCR定量了肺和腦組織中病毒2A基因的轉錄水平。與DMSO相比，DMC顯著降低了2A基因表達，而在相同條件下，CUR僅表現出微弱且不顯著的抑制作用。總體而言，這些數據凸顯了DMC比CUR具有更好的穩定性和抗病毒效果。

在感染EV-D68的橫紋肌肉瘤細胞（RD細胞）中進一步評估了這些化合物的細胞毒性和抗病毒效果。DMC顯示出比CUR略高的細胞毒性，但更有效地抑制了病毒2A基因的表達。

盡管CUR和DMC的抗病毒有效濃度不同，但兩種化合物都能有效抑制病毒。進行了RNA-seq分析以識別兩種藥物在EV-D68感染期間調控的潛在共同靶點，揭示了兩個治療組之間共享的2282個上調基因和1996個下調基因。Reactome通路富集分析顯示，上調基因與基因表達、細胞應激反應、干擾素信號傳導和ER-吞噬體通路相關，而下調基因主要與DNA鏈延伸過程相關。先天免疫基因的熱圖分析顯示，IFIH1、OAS1、IFITM3、IFNA1和OAS2在CUR和DMC治療組中均上調。在共享的上調基因中，DMC處理后，CRYAB在RD-EV-D68和HepG2-HBV模型中持續增加。RT-qPCR證實，在RD細胞中，DMC引起的CRYAB mRNA上調顯著大于CUR。放線菌酮（CHX）追蹤實驗表明，與陽性對照MG132相比，DMC/CUR沒有顯著影響CRYAB蛋白的穩定性。此外，姜黃素已被證明可調節HSF1活性，誘導其核轉位并與DNA結合以激活HSPs的表達。與DMC/CUR單獨處理相比，添加HSF1抑制劑顯著下調了CRYAB轉錄，表明DMC/CUR對CRYAB的上調是HSF1依賴性的。此外，分子對接結果顯示，DMC和CUR都強烈結合HSF1蛋白。在HepG2-HBV感染模型中觀察到類似的轉錄組反應。分子對接預測了CUR和DMC與CRYAB的結合親和力，DMC與更多的殘基相互作用。然而，免疫熒光（IF）分析表明，兩種化合物都沒有改變CRYAB的亞細胞定位。與sh-NC相比，在CUR或DMC處理的RD細胞中，shRNA介導的CRYAB耗竭導致病毒2A基因表達增加，表明CRYAB確實功能性地參與了兩種姜黃素類化合物的抗病毒活性。

免疫熒光揭示了CRYAB在EV-D68感染期間的細胞內重新分布。CRYAB從在細胞質中彌散分布，轉變為聚集，部分核轉位，最后完全進入細胞核，并伴有初始的核分裂。這些發現表明CRYAB可能通過聚集和潛在的核相互作用發揮功能。在線工具未識別到經典的核定位信號序列。與EV-D68感染組相比，用importin-β抑制劑處理導致CRYAB定位在細胞質，阻止其進入細胞核。免疫共沉淀結果也表明，在EV-D68感染后，CRYAB與importin-β強烈相互作用，而在模擬組中未檢測到相互作用。此外，在劑量依賴性過表達CRYAB后，EV-D68感染后細胞呈現減少的細胞病變效應，胞質空泡化減少，細胞死亡水平降低。還觀察到深色的核點，表明核固縮。透射電子顯微鏡揭示了明顯的超微結構差異。在載體轉染的細胞中，細胞核保持完整的核仁和核膜，胞質中的病毒樣囊泡被線粒體包圍。CRYAB過表達后，細胞核分裂，顆粒狀結構在核周積累。

為了探索CRYAB核質轉運的機制，在CUR和DMC處理后進行了代謝組學分析。兩種化合物顯著改變了氨基酸和核苷酸代謝途徑。差異豐度代謝物的比較分析顯示，兩個治療組中核酸相關代謝物的比例都很高。同樣，與載體對照相比，CRYAB過表達顯著調節了嘌呤和核苷酸代謝，并且CRYAB過表達上調了抗病毒相關通路和胞質DNA感應通路。CRYAB調控的差異表達蛋白的EggNOG功能富集分析顯示，上調的DEPs主要與轉錄相關，而下調的DEPs則在能量產生/轉換以及脂質轉運和代謝方面富集。此外，CRYAB組的整合蛋白質組學-代謝組學分析證實了嘌呤和核苷酸代謝通路的富集。

為了闡明CRYAB調節核酸代謝的分子機制，我們進行了結合蛋白質組學、翻譯后修飾分析和免疫沉淀-質譜的綜合分析。總共鑒定了29個與CRYAB相互作用的上調DEPs，包括OAS1、IFNAR1和IFIT1，以及16個下調的DEPs，如DHFR、VTN和NT5DC2。

KEGG通路富集分析顯示，上調的蛋白質及其相互作用物主要參與內吞作用和抗原加工/呈遞通路，而下調的蛋白質則在代謝通路中富集。通過iPTH 3.0的進一步通路分析表明，下調的蛋白質主要與脂質和能量代謝相關，而上調的蛋白質及其相互作用物則在核酸代謝中富集。

EV-D68感染的RD細胞的蛋白質組學和轉錄組學分析顯示，與載體對照細胞相比，CRYAB過表達顯著上調了先天免疫基因的表達。通過STRING生成并通過Cytoscape可視化的蛋白質-蛋白質相互作用網絡突出了hub-up-IP和hub-down-IP簇內的復雜關聯。

與從STRING數據庫參考預測的相互作用相比，使用ClusPro2.0進行的分子對接顯示，CRYAB基于更低的能量分數與兩個蛋白質簇表現出更強的結合親和力。LigPlot+分析進一步顯示，CRYAB與其實驗鑒定的伙伴形成了比STRING預測的更廣泛的氫鍵和疏水相互作用。值得注意的是，RBM26表現出與CRYAB的高親和力結合，涉及28個殘基的疏水相互作用和37個殘基的氫鍵結合。

PTM數據的Reactome通路富集顯示，磷酸化和泛素化蛋白質在與代謝、蛋白質穩態、免疫反應和RNA加工相關的通路中富集。蛋白質組學和PTM數據的整合表明，CRYAB過表達增加了基礎RBM26蛋白水平，同時顯著降低了RBM26的磷酸化和泛素化，表明CRYAB可能通過直接結合抑制其泛素介導的降解來穩定RBM26。

分子動力學模擬顯示，CRYAB-RBM26復合物在前30納秒內經歷了顯著波動，但隨后趨于穩定。分子間氫鍵數量始終保持在20個以上，并增加到80個，反映了強大而持久的相互作用。通過MM/GBSA計算的結合自由能保持在約-145.93 kJ/mol，表明界面穩定且能量有利。吉布斯自由能景觀分析證實了這種穩定性，揭示了多個具有密集氫鍵和互補疏水接觸的低能量構象。對接研究進一步顯示，RBM26幾乎占據了CRYAB的整個表面，為其高親和力、多狀態相互作用提供了結構基礎。

免疫共沉淀證實，EV-D68感染增強了CRYAB-RBM26的相互作用。Sh-CRYAB增加了RBM26的泛素化，而外源性CRYAB以劑量依賴的方式降低了RBM26的泛素化。根據分子對接結果，根據CRYAB的功能域特征構建了一系列點突變載體，免疫共沉淀結果顯示A1和A2突變體失去了與RBM26結合的能力，并且這些位點位于CRYAB的結晶蛋白結構域。接下來，RBM26的泛素化表明，與野生型CRYAB相比，A1和A2突變體表現出微弱的抑制作用，而RBM26在B1和B2組中保持低水平的泛素化。

測序結果顯示，RBM26的特異性泛素化位點可能是K529和K538。我們隨后構建了RBM26 K位點突變質粒，結果顯示K529和K538對RBM26的泛素化都是必需的。鑒于K48連接的多聚泛素化是介導蛋白酶體降解的經典標志，我們的結果顯示，與野生型Ub質粒相比，Ub-K48突變質粒組中RBM26的泛素化水平極低，與空白對照組相似，表明EV-D68感染誘導的RBM26泛素化依賴于K48連接的多聚泛素化。CHX追蹤實驗表明，CRYAB減輕了病毒誘導的RBM26降解，從而保持了RBM26蛋白的穩定性。值得注意的是，在EV-D68感染時，CRYAB從細胞質轉位到細胞核，導致與RBM26幾乎完全的核共定位。

RBM26的過表達顯著降低了病毒2A基因的轉錄水平。轉錄組學分析顯示，被RBM26單獨或與CRYAB組合恢復的基因在與細胞因子信號傳導、干擾素信號傳導和更廣泛的干擾素反應相關的通路中顯著富集。值得注意的是，RBM26和CRYAB的共表達導致免疫相關通路中最顯著的富集。這包括協同上調關鍵的抗病毒效應因子，如STAT2、GBP5、IFIT1B和MX1。基因集變異分析顯示，在共同恢復組中，病毒周期負調控和抗原呈遞通路富集，而RBM26的敲低則有利于與病毒復制和受損mRNA調控相關的通路。

為了進一步探索RBM26調控的靶基因，我們進行了維恩分析，確定了11個在RBM26沉默后上調并在RBM26重新表達后下調的基因。此外，發現7個基因在RBM26沉默后下調并在RBM26重新表達后上調。這些基因被發現形成一個交互網絡，暗示了潛在的功能關系。總之，這些結果表明，CRYAB不僅通過抑制病毒誘導的泛素化來穩定RBM26，而且還協同放大RBM26驅動的、對先天抗病毒免疫至關重要的轉錄程序。

RBM26是一種已知調節mRNA剪接的RNA結合蛋白，對選擇性剪接事件具有廣泛影響。RBM26的過表達顯著增加了全局AS活性，主要是通過誘導外顯子跳躍事件。ΔPSI分析揭示了不同的剪接模式：RBM26過表達促進了SE型變化，而RBM26敲低主要影響了5'端可變剪接事件。值得注意的是，RBM26和CRYAB的聯合過表達引發了最多樣化的AS譜，包括互斥外顯子和內含子保留。

比較AS分析顯示，580個基因在各組中普遍受到影響，其中RBM26敲低組有195個獨特調控基因，RBM26+CRYAB共同恢復組有1423個獨特事件。這些AS基因的表達譜分析顯示，RBM26和RBM26+CRYAB組的表達離散度和平均表達量增加，呈現RC > SiR > R的層次趨勢。基因集富集分析將RBM26敲低特異性基因與蛋白質二聚化活性聯系起來，而RBM26+CRYAB特異性AS基因則在與激酶結