《HUMAN MUTATION》：P4HA2 Participates in Pathogenesis of Refractive Error by Regulating Collagen Posttranslational Modification and Extracellular Matrix Balance
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本研究發現，脯氨酰-4-羥化酶II（P4HA2）基因的缺失，會降低膠原蛋白中特定脯氨酸殘基的羥化水平，進而削弱膠原纖維的熱穩定性，導致其在鞏膜和角膜中發生時間依賴性的排列紊亂和密度降低。同時，細胞外基質（ECM）組分失衡（如膠原蛋白I減少、纖連蛋白增加），最終引發光通路改變和視覺功能障礙。這為理解高度近視（HM）的遺傳與分子機制提供了新的視角。
1. 引言
近視，特別是高度近視（HM），已成為一種日益普遍的全球性視力問題。據預測，其患病率將持續攀升，其中約20%的病例屬于HM，被定義為屈光度小于-6.0 D。HM的特征是眼軸（AL）過度伸長、鞏膜變薄和視力進行性下降，它已是東亞地區不可逆性失明的主要原因。其病因復雜，涉及環境和遺傳因素的共同作用。近年來的研究已發現包括BSG、P4HA2、LEPREL1、ZNF644、SLC39A5、VIPR2和ARR3在內的多個與HM相關的基因。針對HM發病機制的研究主要集中在細胞外基質（ECM）的重塑與退化，特別是鞏膜區域。膠原蛋白翻譯后羥化修飾相關基因（如P4HA2和LEPREL1）的突變已在HM家系中被發現。本研究聚焦于P4HA2基因，通過在動物和細胞模型中進行功能研究，旨在闡明其在HM發病過程中的作用機制。
2. 材料與方法
研究構建了P4HA2基因敲除的C57BL/6小鼠（P4ha2?/?）和P4HA2敲除的HEK293細胞系。通過水體視覺測試評估小鼠的視敏度。利用光學相干斷層掃描（OCT）和偏心紅外屈光儀（EIR）測量了小鼠在不同周齡（4周和8周）時的一系列眼部生物參數，包括角膜厚度、前房深度（ACD）、晶狀體厚度（LT）、玻璃體腔深度（VCD）、眼軸長度（AL）和角膜曲率半徑。通過視網膜電圖（ERG）和OCT評估了視網膜功能與結構。利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察了鞏膜和角膜膠原纖維的超微結構。通過熱穩定性試驗和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析了膠原蛋白的熱穩定性及其脯氨酸羥化水平（4Hyp）。使用免疫印跡和免疫熒光技術檢測了角膜、鞏膜組織及細胞中膠原蛋白I和纖連蛋白的表達水平與定位。
3. 結果
3.1. P4ha2?/?小鼠表現出視覺功能受損
與野生型（WT）小鼠相比，8周齡的P4ha2?/?小鼠視敏度顯著下降（p < 0.01），其中位數視敏度為0.3 cpd，而野生型為0.47 cpd。
3.2. P4ha2?/?小鼠表現出異常的眼部結構
通過OCT監測發現，與WT小鼠相比，P4ha2?/?小鼠在4周齡時已表現出角膜曲率半徑顯著減小（p < 0.01）和玻璃體腔深度增加（p < 0.05）。到8周齡時，這種趨勢更為明顯，其前房深度更深（p < 0.01）且玻璃體腔長度進一步增加（p < 0.0001）。盡管眼軸長度在兩組間未見統計學差異，但通過EIR測量發現，8周齡KO小鼠的角膜中央屈光度更低。ERG測試和視網膜結構分析則表明，P4ha2?/?小鼠的視網膜功能和結構相對完好。
3.3. P4ha2?/?小鼠鞏膜和角膜中的膠原含量呈現進行性減少
通過TEM對8周齡和16周齡小鼠眼球進行超微結構觀察發現，與WT小鼠相比，P4ha2?/?小鼠角膜的膠原纖維排列紊亂，鞏膜外層膠原纖維更稀疏。在16周齡時，這種膠原纖維排列紊亂和稀疏的現象更為顯著，其纖維數量（密度）和平均直徑均顯著減小。蛋白質印跡分析進一步顯示，在8周齡P4ha2?/?小鼠的角膜和鞏膜組織中，膠原蛋白I的表達水平降低，而纖連蛋白的表達水平升高，表明ECM成分失衡。
3.4. 由于非(GPP)n位點P181、P182、P197和P200的脯氨酸羥化缺失，膠原熱穩定性降低
對從小鼠角膜中提取的膠原蛋白進行熱穩定性測試發現，P4ha2?/?小鼠來源的膠原在37°C時即發生降解，而對照組膠原在38°C時仍保持穩定，這表明P4HA2缺失導致膠原熱穩定性下降。LC-MS/MS質譜分析揭示了羥化水平變化的具體位點。在膠原蛋白I的α1鏈中，對穩定性至關重要的保守(GPP)n重復序列（如位點P1169， P1172， P1175， P1178）的羥化水平并未改變。然而，在非(GPP)n的其他位點，特別是P181、P182、P197和P200，其4Hyp水平顯著降低。這種不均衡的羥化缺失，尤其是EPG序列（如P197和P200）位點的完全羥化缺失，是導致膠原熱穩定性下降的主要原因。
3.5. 細胞外基質相關蛋白在脯氨酰-4-羥化酶II缺失的細胞中表現出失衡和積累
為了探究P4HA2缺失導致膠原纖維稀疏的機制，研究構建了P4HA2敲除的HEK293細胞系。蛋白質印跡結果顯示，在該細胞中，膠原蛋白I表達減少，而纖連蛋白表達增加，這與在體組織中的發現一致。同時，細胞培養基上清液中膠原蛋白I的C-端前肽含量未變，表明膠原蛋白I水平的下降并非由其分泌減少引起，而是更多地源于其降解。免疫熒光實驗進一步發現，在P4HA2敲除細胞中，膠原蛋白I異常積聚在內質網中。這種積累與膠原轉運蛋白復合體組分KLHL12無共定位，提示該現象可能并非由轉運障礙導致，而更可能與未充分羥化、穩定性差的膠原在內質網中被降解有關。
4. 討論
本研究首次揭示了P4HA2基因敲除小鼠表現出與HM患者相似的視功能損害表型。綜合各項檢測結果，P4ha2?/?小鼠表現出異常的眼部光學結構，但其視網膜結構和功能正常。超微結構分析顯示，其鞏膜和角膜膠原纖維存在排列紊亂、稀疏和時間依賴性的退化。
膠原蛋白中含有約22%的脯氨酸或羥脯氨酸，這對穩定膠原三螺旋結構至關重要。其中，由脯氨酰-4-羥化酶催化的、位于Gly-Xaa-Yaa重復序列中Y位的脯氨酸羥化，能顯著提升膠原的熱穩定性。本研究發現，在P4ha2?/?小鼠中，膠原蛋白I的α1鏈上關鍵的(GPP)n重復序列羥化水平得以保留，這解釋了為何該小鼠未出現與骨骼發育相關的嚴重表型（如成骨不全）。然而，在其他非(GPP)n位點，特別是EPG序列（P197和P200），其羥化幾乎完全缺失，這直接導致了膠原熱穩定性的下降，使其在生理溫度下易于降解，這可能是HM患者視力進行性下降的潛在分子基礎。
此外，研究觀察到P4ha2?/?小鼠和P4HA2敲除細胞中，均存在ECM組分的失衡：膠原蛋白I減少，纖連蛋白增加。這種組分的改變會影響組織的折射率。已知人角膜的折射率（1.401至1.373）主要受膠原蛋白I（折射率約1.43）的影響。膠原蛋白I的減少和纖連蛋白的增加，結合前房深度變淺、玻璃體腔加深等結構改變，共同導致了光通路的變化，從而引發屈光不正。這一機制也解釋了為何在一些HM基因編輯小鼠模型（如Vipr2?/?小鼠）和部分HM患者（如Cohen綜合征患者）中，即使眼軸長度未顯著變化，仍會出現嚴重的屈光不正癥狀。
總之，P4HA2通過調節膠原蛋白的翻譯后羥化修飾，影響其熱穩定性和降解，進而導致鞏膜和角膜ECM成分失衡（膠原減少、纖連蛋白增加），改變眼球屈光系統的光學特性與光路，最終參與高度近視相關屈光不正的發病及其進行性惡化過程。本研究闡明了P4HA2在HM中的新機制，為理解遺傳性近視的病理生理學提供了重要依據。
