引言

大醬是一種起源于中國東北的傳統調味品，通過純大豆和面粉發酵制成。它被認為具有降低膽固醇、血壓以及抗癌等特性。傳統制備方法往往缺乏嚴格的操作規程，導致品質不一。相比之下，工業化生產采用人工接種發酵，具有周期短、品質均一等特點，但可能影響其獨特風味。近年來，為了豐富風味并賦予大醬特定功能特性，研究者們開發了添加其他原料的新產品。例如，有研究使用苦蕎粉和大豆制作大豆醬，發現添加苦蕎增加了總酸和總氨基酸氮含量，從而改善了整體風味。

花生在中國廣泛種植，含有多種對人體代謝有益的活性成分。研究表明，食用花生與控制血壓、降低心血管疾病風險、減少膽結石、肥胖、2型糖尿病和癌癥發病率相關。花生蛋白質與鷹嘴豆和大豆更為相似。此外，花生因其獨特風味和營養成分常被用于食品中。花生加工過程中產生的吡嗪和美拉德反應產物等化合物顯著貢獻了產品的風味。

風味是決定消費者接受度的主要因素，也是感官品質的關鍵指標。風味物質的形成相當復雜，受原料、微生物組成、發酵周期、環境因素和鹽度等多種因素影響。本研究將花生引入大醬的制曲過程，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）和凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）進行人工接種，開發出一種具有更佳食用品質的新品種大醬。該產品解決了傳統大醬風味單一的問題，并揭示了2,3,5-三甲基吡嗪、異戊醇等化合物是增強花生大豆醬風味的關鍵貢獻者。

材料與方法

花生品種白沙和G965由遼寧正業花生生產產業發展有限公司提供。大豆原料、鹽和面粉購自遼寧省沈陽市當地農貿市場。分析用化學品和溶劑為分析純或高效液相色譜（HPLC）級。米曲霉、凝結芽孢桿菌和三氯乙酸購自國藥集團化學試劑有限公司（北京，中國），而甲酸、甲酸銨和正己烷購自Sorabio（北京索萊寶科技有限公司）。

將400克花生和1600克大豆用純凈水沖洗三次，然后浸泡12小時。去除花生紅皮后，將其與大豆一起蒸熟并混合。隨后加入300克面粉并充分混合。將混合物冷卻至37°C，接種0.5%的混合菌（米曲霉和凝結芽孢桿菌，1:1），然后制成方塊（20 × 10 × 6 cm），在32°C培養箱中培養28天，之后切成小塊（2 × 1 × 1 cm）放入罐中。加入三倍于醬塊體積的鹽水，濃度達到12°Bé，隨后每天攪拌100次，并在自然條件下發酵。相同工藝用于制作普通花生大豆醬（P）和高油酸花生大豆醬（G）。此方法也用于制備純大豆醬（D），使用2000克大豆。

采用酸堿滴定法測定發酵醬中的氨基酸氮（AAN）含量。

樣品預處理：向20 mg樣品中加入141 μL水和100 μL 0.15% 十二烷基辛基碳酸酯，隨后加入4 μL內標溶液（Lysine-d4/Tryptophan-d5/Glutamine-d4, 100 μg/mL）。混合物在40 kHz下超聲處理10分鐘，然后加入5 μL 10 M三氯乙酸，冷凍沉淀10分鐘。離心（14,000 g，10分鐘，4°C）后，收集25 μL上清液并加入375 μL水。混合物渦旋、過濾，收集上清液用于進一步分析。

色譜分析：使用Agilent AdvanceBio MS Spent Media色譜柱（2.1 × 50 mm，2.7 μm），柱溫40°C，進樣體積1 μL。流動相A為含0.1%甲酸和10 mM甲酸銨的95%水溶液，流動相B為含0.1%甲酸和10 mM甲酸銨的95%乙腈溶液。

質譜分析：使用QTRAP 6500+系統，正負離子模式，參數設置：氣簾氣35 psi，碰撞氣中等，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，噴霧電壓5500 V，離子源加熱溫度550°C。

使用P25圓柱形探頭和質構剖面分析（TPA）模式測定大醬發酵過程中的硬度和彈性。測量參數為：預測試速度2 mm/s，測試速度1 mm/s，返回速度1 mm/s，觸發力0.07 N，目標值10 mm。

色度計校準后，將適量均勻研磨的豆醬加入容器并鋪于底部，置于色度計指定位置，蓋上保護蓋進行顏色測定。測量后，將樣品分別旋轉90°和180°繼續測量，記錄樣品的L、a和b*值。

將10克均勻研磨的樣品溶解于蒸餾水中至100 mL。溶液在室溫下靜置2小時，然后以10000 rpm離心10分鐘。上清液過濾后置于小燒杯中進行電子舌測試，評估酸味、苦味、鮮味、澀味、咸味、豐富度、后味-A（澀味后味）和后味-B（苦味后味）。

將10克樣品放入50 mL離心管中，用塑料薄膜密封并蓋緊。靜置15分鐘使氣味均勻分散，然后將電子鼻針頭插入管內進行測量。程序設置為傳感器自清潔90秒，樣品分析120秒，在系統相對穩定的117–119秒時獲取結果。

將約2.0克樣品置于20 mL頂空瓶中，加入2.0 μL 100 μg/mL 正十五烷-d32，并立即密封頂空瓶。

將770 μL正己烷加入1.5 mL離心管中，依次加入適量C10–C25商業混合標樣以及C26、C27、C28、C29和C30正構烷烴標樣，渦旋混合得到C10–C30正構烷烴混合儲備液（50 μg/mL）。

將2.0克樣品放入20 mL頂空瓶，加入2.0 μL內標（正十五烷-d32，100 μg/mL），立即密封，隨后在80°C平衡20分鐘，纖維頭在240°C老化5分鐘，樣品吸附20分鐘，解吸2分鐘。

質量控制（QC）樣品是P、G和D三種大醬的混合物，均接受相同處理。在檢測過程中插入三個QC樣品；QC樣品的重復性反映了分析過程中儀器的穩定性，從而確保了結果的可靠性。

根據公式 ROAV_i= (C_i/T_i) / (C_max/T_max) × 100 進行計算，其中C_i為組分的相對含量（%），T_i為組分的感官閾值（μg/kg），C_max為對樣品風味貢獻最大的組分的相對含量（%），T_max為對樣品風味貢獻最大的組分的感官閾值（μg/kg）。

所有實驗均進行三次重復。數據使用SPSS 27軟件進行分析，以均值±標準差表示，并使用ANOVA進行比較。統計圖和主成分分析使用Origin 2021進行。PEN3電子鼻軟件WinMuster用于主成分分析和數據記錄。揮發性風味化合物分析使用六次獨立實驗。創建搜索庫后，使用補充、歸一化和對數轉換對矩陣文件進行預處理，以消除或減少可能的誤差，并使用SPSS 27軟件分析代謝物的相對豐度，以均值±標準差表示。

結果與分析

AAN含量是衡量大醬品質的關鍵指標，它不僅反映大醬的成熟度，也反映其風味特征。如圖所示，三種大醬的AAN含量隨發酵時間延長而顯著增加（p < 0.05），其中G組觀察到的最高值為0.93 g/100 g，這與相關研究結果一致。

游離氨基酸不僅是重要的風味物質，也是重要揮發性風味化合物的前體，其含量和類型直接影響食物的口感。同時，氨基酸的產生對大醬的成熟有顯著貢獻。特定氨基酸的比例也是大醬營養價值的重要指標。

如表1所示，三種大醬中游離氨基酸的含量隨時間增加。在發酵第56天，相對于D組，添加花生的兩個樣品中丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量更高。精氨酸通常存在于花生中，可以調節血清胰島素水平并減少肝臟中的膽固醇合成。

大醬的獨特風味源于多種呈味氨基酸的協同作用，因此特定氨基酸的相對豐度直接影響大醬的風味和口感。根據風味可將氨基酸分為甜味、鮮味、苦味和無味四類。在P組中，這些風味相關氨基酸的含量排序為甜味 > 苦味 > 鮮味 > 無味。G和P組均含有較高的鮮味氨基酸。

三種大醬中必需氨基酸、非必需氨基酸和條件必需氨基酸的含量隨發酵時間逐漸增加，含量排序為非必需氨基酸 > 必需氨基酸 > 條件必需氨基酸。根據聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織推薦的理想蛋白質模型，三個樣品的E/N比值均高于0.6，E/T比值均高于0.4，表明三者均具有較高的營養價值。

大醬的質地是影響消費者選擇的重要因素。如表3所示，硬度隨著發酵時間的延長逐漸降低，然后趨于穩定——具體而言，從初始值2.63 ± 0.26 N降至0.21 ± 0.02 N后進入穩定階段。這是因為蛋白質、脂肪和碳水化合物被分解成更小的成分，使得大醬逐漸變軟。彈性也隨著發酵時間的延長而逐漸降低——具體而言，彈性值從初始的6.96 ± 0.19 mm降至1.87 ± 0.29 mm。這可能是因為在制曲過程中水分蒸發，導致醬塊中的空隙變大。這可以解釋為什么發酵初期彈性較高，隨后隨著翻動次數增加和發酵時間延長，醬塊碎裂，彈性下降。隨著發酵時間延長，粘附性逐漸降低——具體而言，粘附值從初始的1.24 ± 0.08 N降至0.12 ± 0.01 N。這可能是因為在發酵初期，醬塊較大，鹽水滲透不完全，導致醬塊含水量低。咀嚼性反映了將半固態物質分解至可食用狀態所需的能量。因此，P在發酵早期具有較大的咀嚼性（8.67 ± 0.67 N）。然而，受微生物代謝活動、外部鹽水濃度和水分條件的影響，醬塊硬度下降，導致粘附性降低。同樣，隨著時間的推移，D的內部結構也逐漸降解和分散，硬度和咀嚼性均降低。

如圖所示，電子舌的傳感器對不同發酵時間的大醬樣品的滋味響應程度不同。觀察到最強的信號對應于咸味、豐富度和鮮味，而酸味的信號最弱。P的滋味信號隨著發酵期的延長而減弱。總之，發酵P的主要風味是鮮味、咸味和復合滋味，酸味、苦味和澀味減弱。

主成分分析（PCA）圖顯示，PC1和PC2在三個樣品中分別貢獻了49.0%和35.3%。圖顯示，在PC1方面，G和D之間的距離相對較大，表明它們之間的滋味存在顯著差異，而G與D有一定重疊，表明相似性更大。P和D之間沒有重疊，表明滋味存在差異。因此，使用電子舌可以有效區分花生大豆醬和純大豆醬。

電子鼻傳感器的雷達圖顯示了三個樣品的整體氣味響應。圖中描繪的10個傳感器對不同發酵時間的樣品均有不同程度的響應。值得注意的是，四個傳感器W5S、W1S、W1W和W2S的信號響應值顯著且不同，表明樣品在整個發酵過程中氮氧化物、甲基、硫化物、醇類、醛類和酮類的含量發生了顯著變化。其余六個傳感器的響應在發酵過程中略有重疊，表明這些傳感器檢測到的揮發性物質在過程中保持穩定，且組成基本相似。

如圖所示，三個樣品在PC1上顯著分離，表明存在明顯差異。在PC2方面，樣品G和P緊密聚集，而兩者均與樣品D相距較遠，表明添加花生的大醬在風味上具有相似性，且與純大豆醬存在顯著差異。PCA圖清楚地顯示三個樣品之間沒有重疊，區分度高，表明樣品風味各異，且花生的加入對大醬的風味譜有顯著影響。

載荷圖的分析可以識別對Dajiang風味有顯著影響的氣味。在圖中，第56天，W5S、W2S、W1S和W1W傳感器對PC1的貢獻最大，而W1W和W6S傳感器對PC2的貢獻顯著。就各傳感器的性能特征而言，PC1對氮氧化物、醇類、醛類、酮類、甲基和無機硫化物最敏感，而PC2對無機硫化物和氫化物敏感。

非靶向代謝組學樣品的結果如圖所示，表明同組樣品間具有很強的相關性。PCA1和PCA2的貢獻率分別為23.1%和38.1%，總貢獻率為61.2%。分析三個樣品在PC1軸上的位置，發現P和G的成分相似，而它們與D之間存在顯著差異。在PC2上，D和P的成分相似，但它們與G之間存在顯著距離。圖中可以明顯看出三個樣品有顯著區分，表明它們之間存在顯著差異。

如圖所示，在樣品P、G和D中分別檢測到42、40和34種代謝物。與D相比，花生的添加導致了更多被鑒定的代謝物。

三種樣品共有31種代謝物，P和G之間有5種代謝物相同。P和D之間有一種代謝物相同，G和D之間有一種代謝物相同。在樣品P中發現了五種獨特的風味物質：2,5-二甲基吡嗪、苯甲腈、二苯甲酮、苯乙酸異戊酯和異丙醇。樣品G中有三種獨特的風味化合物：3-戊酮、1-甲基環戊醇和3-戊醇乙酸酯。D有一種獨特的風味物質：苯亞甲基二乙酸酯。

為了進一步研究單個樣品中代謝物的相對豐度，繪制了聚類熱圖（圖）。熱圖清楚地區分了三種樣品：P和G在代謝物豐度上高度相似且緊密聚集，而D與其他兩組明顯獨立，表明其代謝物譜與其他兩者存在顯著差異。聚類結果進一步證實了代謝物在區分純大豆醬和花生大豆醬方面的重要作用。

如表4和圖10所示，酯類和醇類是兩種最普遍的化合物，這意味著它們是大醬風味的主要貢獻者。特定化合物的種類和濃度在三組樣品中以不同程度變化。酯類化合物占總揮發性風味化合物的26.1%；它們在花生大豆醬中含量最高，賦予果香、甜香和酯類香氣。例如，棕櫚酸乙酯和亞油酸乙酯具有果香。乙酯可用于監測大醬成熟的效果。醇類是大豆醬中第二豐富的揮發性化合物，貢獻清新的果香和草本風味。苯乙醇具有玫瑰般的甜香，是醬油、醋和甜面醬等發酵豆制品中的關鍵芳香添加劑。在醇類組中，1-辛烯-3-醇、蘇里尼醇（1-苯乙醇）和苯乙醇在D樣品中含量更高。1-苯乙醇可用作食品調味劑和制藥中間體。有研究稱1-辛烯-3-醇是生大豆不良風味的原因。也有報道稱1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征產物，與強烈的蘑菇氣味有關。酸類占總揮發性風味化合物的6.5%；這些酸性化合物可以通過大豆醬中乳酸菌和酵母等微生物的發酵或酯分解產生。醛類占總揮發性風味化合物的8.7%，賦予堅果味、青草味和果香。它們可以通過發酵過程中的脂質氧化和降解產生。酮類和烴類各占總揮發性風味化合物的6.5%。酮類通常通過微生物發酵介導的脂質和氨基酸降解產生，有助于發酵食品的果味和榛子香氣。風味譜顯示，P和G中的含量比D更豐富。甲氧基苯酚是一種揮發性化合物，賦予發酵食品獨特的煙熏味和酚類氣味。2-戊基呋喃和2,3-二氫苯并呋喃通過熱解產生，具有強烈的香氣、甜味和燒焦氣味。吡嗪是脂肪氧化和美拉德反應的產物，是大豆醬的特征。其含量可能受蒸煮條件、曲料比例、巴氏殺菌和豆醬陳化時間的影響。這些化合物具有烤土豆、炸花生和堅果的強烈香氣。