《HUMAN MUTATION》：Analyses of ATP7B mRNA in Nasopharyngeal Swab Samples Increase Yields of Wilson Disease Molecular Genetic Diagnostics
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這篇研究提出了肝豆狀核變性(WD)分子診斷的新策略。針對ATP7B基因低頻同義變異等“意義不明”變異的檢測難題，研究團隊發現并證實了鼻咽拭子作為非侵入性替代組織樣本的可行性，其ATP7B mRNA表達譜與肝臟相似。通過長讀長納米孔測序分析cDNA擴增子，該方法成功揭示了四例常規遺傳診斷未能確診的患者中由同義或無義變異導致的異常剪接事件，明確了雙等位基因致病性變異，從而獲得了確診。這項創新技術為WD及其他受限于組織特異性表達的遺傳病的精準診斷提供了新途徑。
1. 引言
肝豆狀核變性(WD， OMIM 606882)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，由銅轉運蛋白基因ATP7B的雙等位基因致病性變異引起，導致銅在肝臟和大腦等器官中異常蓄積。其診斷具有挑戰性，臨床表現多樣，包括肝臟疾病（肝炎、肝硬化、急性肝衰竭）、神經精神癥狀以及腎臟、骨關節、內分泌或心臟病變。目前的WD診斷算法依賴于萊比錫評分，該評分結合了臨床評估、Kayser-Fleischer角膜環、生化指標（低血清銅藍蛋白、高非銅藍蛋白結合銅、尿銅排泄增加和肝銅含量增加）以及分子遺傳學分析。
從遺傳學角度看，WD由ATP7B基因的致病性變異導致，包括單核苷酸變異(SNV)、小片段插入缺失、由Alu重復元件介導的大片段基因內缺失以及影響mRNA合成/加工的非編碼變異。常規的DNA測序通常從外周血白細胞(WBCs)提取基因組DNA(gDNA)進行，可以識別出大多數編碼區變異。然而，標準遺傳診斷在約3%–20%的WD患者中仍無法得出結論，部分原因是存在意義不明確或致病性分類沖突的變異，包括可能影響mRNA剪接的同義變異。
驗證這些變異致病性的現有方法，例如侵入性肝活檢取樣、成纖維細胞mRNA分析、白細胞中進行極低表達量的ATP7B檢測或迷你基因剪接測定，均存在各自的局限性。為了克服這些限制，本研究致力于尋找一種易于獲取、能充分表達ATP7B mRNA、可用于體內評估潛在剪接變異影響的臨床樣本。
2. 材料與方法
本研究納入了四名遺傳診斷不完整的WD患者(P1–P4)，其診斷基于特征性的臨床和生化表現以及萊比錫評分超過4分。患者臨床特征包括不同年齡發病，表現為神經癥狀或意外發現的肝功能異常，伴有銅藍蛋白降低、尿銅排泄增加及肝臟病理改變。
研究獲得了查爾斯大學第一醫學院倫理委員會的批準。常規方法：采用Sanger測序和外顯子連接依賴探針擴增(MLPA)技術對ATP7B基因進行檢測。
創新的取樣技術：采用無菌尼龍拭子收集鼻咽拭子樣本。將拭子平行于上顎輕輕插入鼻孔，直至到達鼻咽穹窿，旋轉數次以最大程度收集鼻咽黏膜細胞，采樣后立即浸入RLT緩沖液中保存。
轉錄組分析：從對照個體的鼻咽拭子、肝臟、成纖維細胞和WBCs中分離總RNA，構建鏈特異性rRNA去除文庫，并進行Illumina平臺測序，以評估ATP7B表達水平和轉錄本分布。
擴增子構建與分析：從鼻咽拭子總RNA反轉錄得到cDNA，利用特定引物對ATP7B cDNA中跨越外顯子3至21的區域進行長片段PCR(LR-PCR)擴增，獲得3130 bp的ATP7B_E3-E21產物。同時，也從gDNA中擴增了跨越內含子4至9的ATP7B_I4-I9區域。這些擴增子產物均通過磁珠純化。
測序技術應用：使用牛津納米孔平臺對ATP7B_E3-E21 cDNA擴增子進行長讀長測序；使用PacBio Sequel I系統對ATP7B_I4-I9 gDNA擴增子進行長讀長測序。測序數據經過比對、處理和可視化分析。
生物信息學預測：使用人類剪接查找器專業版(HSF Pro)分析了所鑒定同義變異及無義變異對剪接調控元件（如外顯子剪接增強子ESE和外顯子剪接沉默子ESS）的影響。
等位基因及異構體定量：基于測序數據，根據是否包含完整外顯子等特征對序列讀數進行分組，計算ATP7B轉錄本異構體的比例，并追蹤等位基因特異性變異以確定相性和計算等位基因表達比例。
3. 結果
初始不完整的遺傳診斷：常規Sanger測序在四位患者中均發現了一個已報道的致病性等位基因（等位基因1）和另一個同義變異（等位基因2）。這些同義變異在ClinVar數據庫中被標注為“致病性分類沖突”或“可能良性”，在人群數據庫gnomAD中頻率極低或為零。其中P1患者的變相未知，而P2、P3和P4患者通過父母傳遞分析確定了變異呈反式排列。體外剪接預測分析表明，同義變異c.1488C>T (p.(Gly496=))、c.2292C>T (p.(Phe764=))和c.2241C>T (p.(Ile747=))可能影響ESE和ESS基序，導致ATP7B mRNA剪接異常，而無義變異c.2336G>A (p.(Trp779Ter))則未影響外顯子剪接比例(ESR)譜
鼻咽拭子中ATP7B mRNA高表達：RNA測序數據顯示，ATP7B mRNA在對照鼻咽拭子中豐度最高，TPM（每百萬轉錄本）值為39.5，高于肝臟(TPM = 7.4)、皮膚成纖維細胞(TPM = 3.1)和可忽略不計的WBCs (TPM = 0.3)。鼻咽拭子中的ATP7B mRNA譜與肝臟相似，主要由包含全部21個外顯子的主要異構體(NM_000053.4)構成。研究在鼻咽拭子樣本中獨家鑒定出一個與常規外顯子1豐度約1:1的新型替代外顯子1b。肝臟和鼻咽拭子中的主要異構體（無論起始于外顯子1或1b）約占所有ATP7B轉錄本的70%。
長讀長測序確認患者診斷：對患者及對照的ATP7B_E3-E21擴增子進行納米孔測序分析。在對照樣本中，主要全長轉錄本約占62%，其次是缺乏外顯子8(d8, ENST00000673772.1)的轉錄本（鼻咽拭子11%，肝臟15%），以及缺乏外顯子6-7-8(d6d7d8)的轉錄本（鼻咽拭子6%，肝臟5%）
在患者分析中，這一方法揭示了由同義或無義變異導致的異常剪接，并明確了雙等位基因致病性：
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P1患者：等位基因1(p.(Lys1248fs))轉錄本比例低(7%)，提示無義介導的mRNA衰變(NMD)。從等位基因2(p.(Phe764=))產生的轉錄本以外顯子8跳躍為主(51% d8 和 21% d6d7d8)。總體上，僅3%的轉錄本是全長且可能編碼功能性蛋白質的。
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P2患者：31%的全長轉錄本來自等位基因1(p.His1069Gln)。從等位基因2(p.(Phe764=))產生了顯著增多的d8和d6d7d8轉錄本(24%和15%)。總體全長轉錄本僅占2%。
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P3患者：等位基因1(p.(Trp779Ter))和等位基因2(p.(Ile747=))均主要產生d8和d6d7d8轉錄本。總體上，全長功能性轉錄本僅占13%。
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P4患者：等位基因表達比例約為1:1。等位基因1攜帶p.His1069Gln變異。而從等位基因2(p.(Gly496=))產生的轉錄本中，絕大多數攜帶了外顯子3的部分缺失(del3_57b)。
通過長讀長測序，研究者排除了P1-P3患者內含子中罕見變異對剪接的額外影響，并直接證明了所有四位患者中發現的變異均呈反式排列，即符合復合雜合狀態。這些剪接異常導致了功能性轉錄本比例極低，從而解釋了患者的疾病表型。
4. 討論
本研究的核心新發現是確定了ATP7B基因在鼻咽拭子樣本中高表達。這一發現具有重要的診斷應用價值：利用鼻咽拭子樣本進行長讀長測序分析，能夠有效地在體內驗證變異（包括同義變異）對ATP7B mRNA合成和加工的影響。
最近，有研究提出“無感變異”這一新分類，強調那些通過影響剪接調控、基因表達或導致mRNA剪接缺陷的外顯子替代。本研究中分析的ATP7B同義變異即屬于此類。通過鼻咽拭子mRNA分析，研究者成功驗證了p.(Phe764=)、p.(Ile747=)和p.(Gly496=)等“意義不明”變異的致病性影響。長讀長測序分析不僅揭示了ATP7B轉錄本異構體的多樣性及其比例，還可以輕松評估變異的相性（順式或反式），這在父母無法提供樣本進行遺傳檢測時尤為重要。
數據表明，鼻咽拭子中ATP7B的表達量甚至高于肝臟。兩種組織中ATP7B轉錄本的總體構成和相對豐度相似。唯一的差異是在鼻咽拭子中獨家發現了新型替代外顯子1b。這可能反映了鼻咽黏膜細胞與肝細胞具有共同的發育起源。
在蛋白質層面，研究推測由p.(Phe764=)、p.(Ile747=)和p.(Trp779Ter)導致的外顯子8框內跳躍(d8)，會導致合成的ATP7B蛋白缺乏對于轉運功能和正確蛋白折疊至關重要的跨膜結構域。而P4患者中外顯子3的部分缺失(del3_57b)則預計會編碼缺失部分金屬結合結構域5的ATP7B蛋白。
研究發現，ATP7B基因第5-9外顯子區域本身就富含外顯子跳躍事件（在對照中可高達25%的轉錄本）。但在患者中，所鑒定的同義和無義變異顯著加劇了含有跳躍外顯子轉錄本的比例。長讀長測序顯示，所有四位患者的鼻咽拭子中，能夠翻譯成功能性蛋白質的ATP7B轉錄本比例極低（最高不超過13%）。
目前已有針對WD患者（包括癥狀前個體）的螯合劑或鋅鹽等有效治療方法。因此，驗證ATP7B變異致病性的策略，不僅有助于補充干血斑ATP7B蛋白定量等其他診斷方法，方便受累家庭的遺傳咨詢，也能幫助識別可能從早期治療中獲益的個體。此外，ATP7B變異也被關聯研究報道可能參與阿爾茨海默病等疾病的病理過程，或影響化療反應/耐藥性的級聯效率。因此，有效評估ATP7B變異的影響，可能具有超越WD患者群體的社會醫學意義。最后，鼻咽拭子材料也可能為其他受限于組織特異性表達模式單基因病的分子診斷提供相關基因轉錄本。
5. 結論
研究結果表明，通常在序列數據分析中被排除在外的同義變異，應謹慎看待，并被視為WD的潛在關鍵致病因素。對從易獲取的鼻咽拭子樣本中產生的ATP7B mRNA擴增子進行長讀長測序，有助于識別剪接影響并確定變異相性。這一創新技術為提升肝豆狀核變性的精準診斷效率提供了有力的新工具。
