《Immunity, Inflammation and Disease》：Identification of Ferroptosis-Related Hub Genes and Immune Infiltration Landscape in Chronic Kidney Disease via Bioinformatics and Experimental Verification
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本綜述通過整合生物信息學（加權基因共表達網絡分析WGCNA、蛋白互作網絡PPI、GeneMANIA等）與實驗驗證，系統鑒定了與鐵死亡相關的七個中樞基因（NNMT、GDF15、ACSL1、DLD、NFE2L2、PARP1、NR4A1），證實其在慢性腎病（CKD）進展中顯著上調，是潛在的診斷與治療靶點。研究進一步揭示了CKD中CD8+T細胞、M0巨噬細胞等免疫細胞浸潤的失衡景觀，為探索鐵死亡、免疫失調與腎纖維化的交互作用提供了新視角。
慢性腎病：一個亟待探索的全球健康難題
慢性腎病（CKD）是全球范圍內發病率日益增高、導致全因死亡率上升的重大公共衛生問題。其特點是持續的氧化應激、腎臟免疫失調和慢性炎癥，并可進展為需要透析或腎移植的終末期腎病。然而，CKD背后的病理機制和精確的生物標志物仍不明確，早期篩查和治療面臨挑戰。近年研究發現，一種以脂質過氧化和鐵積聚為特征的調節性細胞死亡形式——鐵死亡，在腎臟疾病中扮演關鍵角色。本研究旨在利用生物信息學手段結合實驗驗證，揭示鐵死亡相關基因在CKD中的作用機制及其診斷潛力。
研究方法：整合數據分析與實驗驗證
本研究的數據來源于基因表達綜合數據庫（GEO），使用了包含腎活檢標本的數據集GSE66494（8例正常對照，53例CKD樣本）和驗證數據集GSE104948（18例對照，50例CKD樣本）。鐵死亡相關基因（FRGs）則來自FerrDB V2數據庫。
首先，研究人員識別了791個差異表達基因（DEGs），包含464個上調基因和327個下調基因。火山圖和熱圖直觀展示了這些差異基因的表達模式。對這些DEGs的功能富集分析表明，它們在cAMP信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、胰蛋白酶代謝等通路中顯著富集。
接下來，通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA），研究人員確定了與CKD高度相關的基因模塊。最終篩選出四個模塊（象牙色、珊瑚色1、淺紫色3、花卉白色），包含3176個基因用于后續分析。
七個核心中樞基因的鑒定與驗證
通過對差異表達基因、鐵死亡相關基因和WGCNA相關模塊基因取交集，研究人員初步獲得了11個候選中樞基因。隨后構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI），篩選出連接度最高的7個中樞基因，分別是：煙酰胺N-甲基轉移酶（NNMT）、生長分化因子-15（GDF15）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員1（ACSL1）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD/DLDH）、核因子E2相關因子2（NFE2L2/NRF2）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）、核受體亞家族4A組成員1（NR4A1）。
利用獨立的驗證數據集（GSE104948），研究人員對這些中樞基因的診斷效能進行了評估。結果顯示，這七個中樞基因的受試者工作特征曲線下面積（AUC）值均大于0.75，表現出優異的診斷性能。這表明它們在區分CKD患者與正常對照方面具有很高的準確性。
中樞基因表達與腎功能指標的關聯
研究人員進一步分析了中樞基因的表達水平與腎功能關鍵臨床指標的相關性。結果顯示：
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NNMT、GDF15、PARP1、NR4A1和NFE2L2的表達水平與血清肌酐呈正相關，而與腎小球濾過率（GFR）呈負相關。這表明它們的上調與腎功能惡化密切相關。
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ACSL1的表達與GFR呈正相關。
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有趣的是，DLD的表達與血清肌酐呈負相關，而與GFR呈正相關。結合后續的功能富集分析結果，暗示DLD可能通過特定通路發揮潛在的腎臟保護作用。
中樞基因影響的通路探索
基因集富集分析（GSEA）揭示了這些中樞基因可能參與調控的關鍵生物學過程和通路：
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高表達NNMT的樣本富集于“免疫系統中的細胞因子信號傳導”。
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高表達GDF15的樣本富集于“細胞周期”、“G1/S特異性轉錄”等通路。
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高表達DLD的樣本富集于“過氧化物酶體脂質代謝”。
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高表達NR4A1的樣本富集于“碳酸氫鹽轉運蛋白”。
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高表達NFE2L2的樣本富集于“TRAIL信號通路”。
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高表達PARP1的樣本富集于“MeCP2調控轉錄因子”。
綜合分析表明，這些中樞基因可能通過調控轉錄后修飾、致病因子轉運、免疫功能障礙和細胞周期失調等機制，共同影響CKD的進展和預后。
慢性腎病中的免疫浸潤圖譜失衡
研究人員利用CIBERSORT算法分析了CKD腎臟樣本中22種免疫細胞的浸潤情況。結果顯示，與正常腎臟相比，CKD腎臟呈現出獨特的免疫細胞浸潤失衡特征：
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浸潤增加的細胞：CD8+T細胞和M0巨噬細胞水平顯著升高。
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浸潤減少的細胞：記憶B細胞、靜息記憶CD4+T細胞、調節性T細胞（Tregs）和靜息肥大細胞水平顯著降低。
CD8+T細胞的顯著增多提示其在驅動腎臟損傷和纖維化中扮演主動角色。研究表明，它們可通過FasL-Fas信號通路誘導腎小管周圍毛細血管內皮細胞凋亡，導致毛細血管稀疏化，引發慢性缺氧，進而驅動腎小管萎縮和間質纖維化。M0巨噬細胞的增多則意味著一個未分化細胞的儲備庫擴大。在損傷的腎臟微環境中，它們受到局部信號調控，可極化為促炎的M1表型或促纖維化的M2表型。M2巨噬細胞是纖維化的關鍵驅動者，能夠大量分泌轉化生長因子-β（TGF-β），后者是纖維化的核心調控因子，可直接激活成纖維細胞并誘導其分化為肌成纖維細胞，從而過度合成和沉積細胞外基質蛋白，最終導致腎小球硬化和間質纖維化。
體外實驗驗證核心基因的功能
為了驗證生物信息學發現的可靠性，研究人員利用轉化生長因子-β1（TGF-β1）刺激人腎小管上皮細胞HK-2，建立了CKD的體外模型。
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蛋白質印跡實驗證實，與對照組相比，TGF-β1處理的HK-2細胞中NFE2L2蛋白表達水平顯著上調。
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查詢人類蛋白質圖譜數據庫顯示，NFE2L2主要在腎臟的腎小管區室表達，而非腎小球區室。
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實時熒光定量PCR實驗進一步證實，在TGF-β1處理的HK-2細胞中，NNMT和GDF15的mRNA表達水平也顯著升高。
結論與展望
本研究通過整合生物信息學分析與實驗驗證，成功鑒定出七個與鐵死亡相關的核心中樞基因（NNMT、GDF15、ACSL1、DLD、NFE2L2、PARP1、NR4A1），證實它們是CKD進展中顯著上調的生物標志物，具有優異的診斷潛力。每個基因都與疾病進展有著獨特的機制聯系：NNMT上調與腎功能指標相關，提示其在CKD代謝重編程和纖維化中的作用；GDF15作為敏感的應激反應標志物，其慢性高水平表達可能反映了腎損傷與纖維化的惡性循環；ACSL1作為經典的鐵死亡促進因子，可能在腎小管細胞中驅動脂質過氧化損傷；DLD的表達模式及其與“過氧化物酶體脂質代謝”通路的關聯，暗示其可能通過調節細胞氧化還原穩態發揮潛在的保護作用；NFE2L2的代償性上調可能是對抗腎臟內氧化應激的關鍵反應；PARP1和NR4A1的異常表達則指向了CKD中DNA損傷反應和免疫代謝調控的失調。
此外，本研究揭示了CKD中獨特的免疫浸潤失衡景觀，其特征是促纖維化的CD8+T細胞和M0巨噬細胞的浸潤增加。這些中樞基因與失調的免疫微環境之間的相互作用，很可能形成了一個惡性循環，持續驅動鐵死亡、炎癥，并最終導致腎纖維化。
綜上所述，這些發現不僅深化了我們對鐵死亡在CKD發病機制中作用的理解，也為開發新型診斷策略和治療干預措施（例如靶向ACSL1、NFE2L2等分子或免疫通路）指明了具體方向。盡管本研究存在樣本量有限、缺乏體內動物實驗驗證等局限性，但其所揭示的鐵死亡相關基因和免疫微環境的相互作用網絡，無疑為未來探索CKD的精準診療開辟了充滿希望的新路徑。
