《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Benzydamine Attenuates Matrix Metalloproteinase-9 Expression Through Inhibition of ERK MAPK in Activated Human Monocytic Cells Under Hyperglycemic Condition
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本篇綜述研究了臨床常用抗炎藥苯達明（Benzydamine）在治療糖尿病合并膿毒癥相關并發癥中的潛在新機制。文章核心發現是，在模擬高血糖環境的條件下，苯達明能顯著抑制內毒素脂多糖（LPS）刺激人單核THP-1細胞產生基質金屬蛋白酶-9（MMP-9），其作用機制是通過特異性抑制細胞外信號調節激酶（ERK）絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號通路的活化，從而減少MMP-9的表達和明膠水解活性。這一發現揭示了苯達明在減輕高血糖相關內毒素血癥中組織降解性炎癥反應方面的新作用，為其拓展用于糖尿病并發癥的抗炎治療提供了理論基礎。
引言：高血糖、膿毒癥與MMP-9的復雜關系
膿毒癥是一種危及生命的感染并發癥，糖尿病患者一旦發生膿毒癥，其死亡率顯著升高。高血糖會創造一個加劇炎癥的惡劣環境，導致包括基質金屬蛋白酶（MMPs）在內的多種促炎分子水平升高，從而延長炎癥反應。其中，基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）不僅在炎癥性疾病發病中起關鍵作用，也是高血糖條件下（如膿毒癥和牙周�。└腥具M展的關鍵介質。單核/巨噬細胞譜系通過釋放MMPs在炎癥重塑中扮演著至關重要的角色。脂多糖（LPS）作為內毒素，能夠通過Toll樣受體4（TLR-4）激活單核細胞，誘導MMP-9產生。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）同樣是MMP-9表達的關鍵誘導因子。因此，闡明能夠抑制MMP-9的藥物機制，對于預防高血糖相關內毒素血癥下的組織降解和尋找抗炎治療新靶點具有重要意義。
苯達明是一種臨床上廣泛用于治療咽炎和牙周炎的非甾體抗炎藥（NSAID），具有局部麻醉和鎮痛特性。先前研究顯示，苯達明在治療膿毒癥、減輕神經炎癥和改善缺血性卒中損傷方面均表現出潛力。本研究旨在探究苯達明在高糖條件下，對LPS刺激的人單核THP-1細胞中MMP-9激活的抗基質降解作用及其機制。
材料與方法
研究使用了人單核白血病THP-1細胞系。細胞分別在正常葡萄糖（11 mM）和高葡萄糖（25 mM）的培養基中進行培養和處理。通過明膠酶譜法分析MMP-9介導的明膠水解活性，蛋白質印跡法檢測MMP-9蛋白及信號通路蛋白（如磷酸化p38、JNK、ERK MAPK和p65 NF-κB）的表達。通過酶聯免疫吸附試驗測定金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的水平。通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測MMP-9 mRNA的表達。通過共聚焦免疫熒光分析觀察磷酸化ERK（pERK）的核轉位情況。通過流式細胞術測定細胞表面TLR-4的表達。采用MTT法評估細胞活力。所有數據均進行統計學分析。
結果
- 1.
苯達明在正常及高糖條件下對LPS誘導的MMP-9的抑制作用：
在正常葡萄糖條件下，LPS刺激顯著增加了THP-1細胞的MMP-9明膠水解活性和蛋白表達，而苯達明預處理能濃度依賴性地抑制這種增強作用。研究發現，高葡萄糖條件本身能加劇LPS誘導的MMP-9明膠水解活性。在此條件下，苯達明同樣能顯著且濃度依賴性地抑制LPS誘導的MMP-9明膠水解活性和蛋白表達。然而，ELISA檢測發現，苯達明僅在高濃度（50 μM）時部分降低了TIMP-1的水平，表明其抑制MMP-9并非通過增加TIMP-1實現。細胞活力試驗表明，50 μM苯達amine會部分降低細胞活力，但MMP-9活性被抑制至接近基線水平，說明其作用不單純源于細胞毒性。在長期高糖條件下，苯達明同樣表現出濃度依賴性的抑制效果。
- 2.
苯達明對TNF-α誘導的MMP-9的抑制作用：
由于LPS能顯著誘導TNF-α產生，而TNF-α本身也可促進MMP-9表達，研究進一步評估了苯達明對TNF-α誘導的MMP-9激活的影響。在正常葡萄糖條件下，苯達明能濃度依賴性地抑制TNF-α誘導的MMP-9明膠水解活性、蛋白表達以及mRNA表達，表明其抑制作用發生在轉錄水平。
- 3.
苯達明對MAPK和NF-κB信號通路的影響：
在高糖條件下，LPS刺激顯著增加了p38、JNK、ERK MAPK以及p65 NF-κB的磷酸化水平。有趣的是，苯達明預處理對LPS誘導的p38和JNK MAPK的磷酸化沒有明顯影響，但能顯著抑制磷酸化p65（NF-κB激活的標志）和磷酸化ERK的表達。這一結果強烈提示，ERK MAPK可能是苯達明發揮抑制作用的關鍵靶點。
- 4.
苯達明對磷酸化ERK核轉位的影響：
共聚焦免疫熒光分析顯示，LPS刺激導致pERK從細胞質轉位到細胞核，而苯達明（50 μM）能夠抑制這種核轉位。經典的ERK抑制劑U0126也表現出相同的抑制效果。明膠酶譜實驗進一步證實，U0126能濃度依賴性地抑制LPS誘導的明膠水解活性，驗證了ERK通路在其中的關鍵作用。
- 5.
苯達明對LPS誘導的表面TLR-4表達的影響：
LPS通過細胞表面受體TLR-4觸發炎癥反應。流式細胞術分析發現，在高糖條件下，LPS刺激顯著上調了THP-1細胞表面TLR-4的表達。苯達明（50 μM）能顯著抑制這種上調作用。同樣，ERK抑制劑U0126也能有效降低表面TLR-4的表達，這與ERK信號參與TLR-4調控的報道一致。
- 6.
苯達明對COVID-19 S1蛋白誘導的MMP-9激活的影響：
補充實驗表明，SARS-CoV-2刺突蛋白S1亞單位也能在高糖條件下刺激THP-1細胞產生MMP-9介導的明膠水解活性，而苯達明對此同樣具有抑制作用，提示其抗炎作用可能對COVID-19相關的炎癥并發癥也有潛在意義。
討論
本研究證實，高糖環境會加劇LPS誘導的單核細胞MMP-9表達。苯達明能夠通過特異性抑制ERK MAPK和NF-κB信號通路的激活，來減輕這種增強的MMP-9表達和活化。苯達明對TNF-α誘導的MMP-9同樣有效，且能抑制其mRNA轉錄，表明其作用涉及基因表達層面。研究還發現苯達明能下調LPS誘導的細胞表面TLR-4表達，這可能與其抑制ERK信號有關。
高血糖作為一種高滲狀態，可能通過影響上游信號分子（如Ras或MEKK1/2）來增強ERK的活化，而苯達明可能作用于這些上游環節。此外，苯達明對COVID-19 S1蛋白誘導的MMP-9激活的抑制作用，為其在應對病毒相關細胞因子風暴和組織損傷方面的潛力提供了線索。
需要指出的是，本研究使用11 mM葡萄糖作為“正�！睂φ眨m略高于生理血糖濃度，但這是THP-1細胞標準培養基的濃度，已被廣泛用于與更高糖條件的比較研究。
結論
總而言之，本研究闡明，苯達明主要通過抑制ERK MAPK信號通路，來減輕高糖條件下LPS激活的人單核THP-1細胞中MMP-9的表達和活化。鑒于苯達明對MMP-9的下調作用，這種具有雙重功能（抗炎、鎮痛）的經典非甾體抗炎藥，值得在動物模型中進行進一步研究，或可作為治療糖尿病內毒素血癥相關組織降解效應的潛在藥物。
