研究者使用來(lái)自相同患者肺腺癌組織的單細(xì)胞懸液，在液滴式(10x Genomics)和微孔式(Singleron)平臺(tái)上進(jìn)行平行測(cè)序。液滴式平臺(tái)獲得了總計(jì)47,401個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，而微孔式平臺(tái)獲得了33,915個(gè)。數(shù)據(jù)質(zhì)量控制(QC)指標(biāo)顯示，液滴式平臺(tái)通常具有更高的總測(cè)序讀段數(shù)(nCount)和每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)(nFeature)，這可能是由于液滴內(nèi)高濃度的寡聚(dT)引物能更有效地捕獲多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本。然而，微孔式平臺(tái)保留了更高比例的成熟mRNA，其外顯子區(qū)域可靠比對(duì)讀段的平均比例高達(dá)87.62%，而液滴式平臺(tái)僅為62.93%。同時(shí)，微孔式平臺(tái)顯示出更高的線粒體基因(%MT)占比以及應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(如FOS, JUN)的表達(dá)水平，表明其可能更偏好于捕獲應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞特征。這些趨勢(shì)在公共數(shù)據(jù)集中得到了驗(yàn)證。

主成分分析(PCA)顯示，平臺(tái)間的批次效應(yīng)超過(guò)了相同組織類(lèi)型樣本間的生物學(xué)差異。UMAP可視化與聚類(lèi)評(píng)估指標(biāo)(調(diào)整蘭德指數(shù)Batch_ARI和平均輪廓寬度Batch_ASW)表明，液滴式平臺(tái)樣本間的批次效應(yīng)小于微孔式平臺(tái)。在整合六個(gè)樣本后，未校正的數(shù)據(jù)顯示出顯著的批次效應(yīng)。應(yīng)用Harmony、Seurat和Liger等主流批次校正方法后，UMAP圖顯示細(xì)胞在各樣本間有效混合，定量指標(biāo)(Batch_ARI和Batch_ASW)均得到顯著改善，證明這些工具能有效緩解跨平臺(tái)的批次效應(yīng)。

批次校正后，細(xì)胞被分類(lèi)為上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。液滴式平臺(tái)捕獲的免疫細(xì)胞比例始終高于微孔式平臺(tái)。然而，微孔式平臺(tái)得到的免疫細(xì)胞平均比例更接近流式細(xì)胞術(shù)的驗(yàn)證結(jié)果。這表明液滴式平臺(tái)可能因主動(dòng)的微流體液滴封裝而高估了懸浮生長(zhǎng)的免疫細(xì)胞的豐度，而微孔式平臺(tái)通過(guò)重力沉降的被動(dòng)捕獲方式更能反映組織的真實(shí)組成。

在細(xì)胞亞型分辨率上，液滴式數(shù)據(jù)集鑒定出8個(gè)細(xì)胞亞型，而微孔式數(shù)據(jù)集鑒定出9個(gè)。一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別是，微孔式平臺(tái)能夠檢測(cè)到一個(gè)獨(dú)特的中性粒細(xì)胞群體，而該群體在液滴式數(shù)據(jù)集中幾乎完全缺失。中性粒細(xì)胞在每個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到的基因中位數(shù)最低，表明微孔式平臺(tái)對(duì)mRNA含量低的脆弱細(xì)胞具有更高的捕獲效率。

基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在同一細(xì)胞類(lèi)型(如成纖維細(xì)胞)中，兩個(gè)平臺(tái)間存在一部分基因表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)，這可能是由于平臺(tái)間不同的RNA捕獲偏好性所致。

細(xì)胞通訊(CellChat)分析顯示，在患者1中，液滴式平臺(tái)推斷出的細(xì)胞間相互作用數(shù)量顯著高于微孔式平臺(tái)，其相互作用網(wǎng)絡(luò)也更廣泛。總體而言，所有患者中，液滴式平臺(tái)的樣本推斷出的相互作用總數(shù)都更高。配體-受體(LR)互作分析表明，液滴式數(shù)據(jù)在多個(gè)關(guān)鍵的免疫相關(guān)信號(hào)通路(如MHC、IL1、TNF)中捕獲了更全面的互作譜。

在免疫細(xì)胞亞群分析中，液滴式平臺(tái)鑒定出5個(gè)T細(xì)胞亞型(包括細(xì)胞毒性CD8⁺效應(yīng)T細(xì)胞、免疫抑制性CD4⁺T細(xì)胞等)，而微孔式平臺(tái)僅鑒定出4個(gè)，缺失了免疫抑制性CD4⁺T細(xì)胞，表明后者在檢測(cè)稀有免疫細(xì)胞亞群方面敏感性相對(duì)有限。

在上皮細(xì)胞亞群分析中，微孔式平臺(tái)鑒定了6個(gè)簇，而液滴式平臺(tái)鑒定了8個(gè)簇，但微孔式平臺(tái)的UMAP圖顯示出更清晰的聚類(lèi)分離。

擬時(shí)序(Pseudotime)分析揭示，液滴式平臺(tái)在上皮細(xì)胞中展現(xiàn)了11種細(xì)胞狀態(tài)和更復(fù)雜的分支進(jìn)化軌跡，而微孔式平臺(tái)僅檢測(cè)到5種狀態(tài)，未能區(qū)分某些關(guān)鍵細(xì)胞狀態(tài)。

本研究系統(tǒng)比較了兩種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在臨床樣本中的表現(xiàn)。最顯著的發(fā)現(xiàn)之一是讀段比對(duì)模式的差異，微孔式平臺(tái)具有更高的外顯子比對(duì)率，而液滴式平臺(tái)則有更高比例的內(nèi)含子比對(duì)。這反映了平臺(tái)在測(cè)序深度、RNA捕獲策略和特異性偏倚上的差異。

研究還強(qiáng)調(diào)了平臺(tái)特異性技術(shù)偏倚對(duì)數(shù)據(jù)整合的重要性。主成分分析和聚類(lèi)評(píng)估指標(biāo)均表明平臺(tái)差異是批次效應(yīng)的主要來(lái)源，但主流校正工具能有效緩解此問(wèn)題。

在細(xì)胞組成方面，液滴式平臺(tái)檢測(cè)到更高比例的免疫細(xì)胞，可能更適用于關(guān)注免疫組成的研究；而微孔式平臺(tái)提供了更接近真實(shí)組織狀態(tài)的免疫細(xì)胞比例，并獨(dú)特地檢測(cè)到了中性粒細(xì)胞，這對(duì)研究骨髓細(xì)胞至關(guān)重要。基因表達(dá)趨勢(shì)和細(xì)胞通訊模式的平臺(tái)間不一致性，提示在解釋低豐度轉(zhuǎn)錄本和推斷細(xì)胞間信號(hào)網(wǎng)絡(luò)時(shí)需要謹(jǐn)慎。

綜上所述，本研究強(qiáng)調(diào)在選擇單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)時(shí)，需仔細(xì)考慮其技術(shù)特性對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量、細(xì)胞類(lèi)型識(shí)別、基因表達(dá)譜乃至生物學(xué)通路富集分析的系統(tǒng)性影響。這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、促進(jìn)跨平臺(tái)數(shù)據(jù)解讀與整合提供了寶貴的見(jiàn)解。