《Molecular Nutrition & Food Research》：Sex-Specific Renal Proteomic Responses to Mycotoxins and Their Mitigation by Bioactive Food Ingredients
編輯推薦：
本研究首次利用蛋白質組學方法揭示了黃曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）對腎臟的性別特異性毒性機制，并評估了發酵乳清（FW）和南瓜粉（P）作為功能性食品成分的緩解效果。文章重點闡述了雄性腎臟對毒素（尤其OTA）更為敏感，而補充FW和P可通過穩定線粒體功能、增強外源物代謝等途徑有效減輕相關蛋白表達紊亂。本文推薦給從事食品毒理學、營養干預和性別醫學研究的科研人員，為開發針對霉菌毒素腎毒性的性別特異性膳食防護策略提供了新見解。
引言
霉菌毒素是一類廣泛存在于食品和飼料中的天然生物毒素，對人類和動物健康構成嚴重威脅。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）被國際癌癥研究機構（IARC）列為1類致癌物，而赭曲霉毒素A（OTA）也被歸類為可能的人類致癌物，二者均具有顯著的腎毒性。腎臟作為主要排泄和再吸收器官，容易受到藥物和毒素的積累，從而增加損傷風險。目前，利用富含生物活性成分的天然食品添加劑來預防或減輕霉菌毒素毒性的策略受到關注。南瓜富含β-胡蘿卜素和番茄紅素等成分，具有抗真菌和抗氧化特性；發酵乳清（FW）作為乳制品副產品，經乳酸菌發酵后，其代謝產物也顯示出抗菌和抗真菌活性。本研究首次在大鼠亞慢性模型中，系統探討了AFB1和OTA單獨或聯合暴露引起的腎臟毒性是否存在性別差異，并評估了膳食中添加FW和P的緩解潛力。
實驗部分
2.1 化學品與試劑
實驗所用OTA和AFB1標準品購自Sigma-Aldrich，純度≥98%。所有工作溶液均避光保存于-20°C。蛋白質提取和消化所需試劑，如DL-二硫蘇糖醇（DTT）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、胰蛋白酶等均購自Sigma Aldrich等公司。
2.2 面粉污染、生物活性成分及飼料制備
大麥和玉米面粉分別使用產毒真菌（產OTA的Aspergillus steynii和產AFB1的A. flavus）進行自然污染。山羊乳清經乳酸菌發酵后凍干成粉，南瓜經去皮、去籽、凍干后研磨成粉。將FW和P以1% (w/w)的比例單獨或共同添加到基礎飼料中，共制備了12種不同的實驗飼料，包括對照組、單一或聯合毒素組、以及添加了功能性成分的干預組。
2.3 體內實驗設計
研究使用了120只Wistar大鼠，隨機分為12組（每組10只，雌雄各半）。經過7天適應期后，對照組飼喂未污染飼料，各實驗組分別飼喂含有霉菌毒素和/或功能性成分的飼料，持續28天。實驗結束后，收集腎臟組織并儲存于-80°C待分析。
2.4 蛋白質提取至2.7 數據分析與生物信息學
腎臟組織經裂解、勻漿、離心后提取蛋白質。蛋白質經過變性、烷基化和胰蛋白酶消化后，使用液相色譜-四極桿飛行時間質譜（LC-QTOF-MS）系統進行肽段分離和分析。質譜數據使用Spectrum Mill軟件進行處理，搜索Homo sapiens數據庫并以1.2%的假發現率（FDR）進行驗證。差異表達蛋白質（DEPs）通過雙向方差分析（ANOVA）結合Benjamini-Hochberg多重檢驗校正進行篩選（p< 0.05，倍數變化≥0.7）。對鑒定到的DEPs進行基因本體（GO）功能富集分析、Reactome通路分析以及蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建，以闡釋其生物學意義。
結果與討論
3.1 實驗飼料中的AFB1和OTA水平
飼料中霉菌毒素濃度測定顯示，OTA濃度（5.4–8.8 μg/g）普遍高于AFB1（4.3–5.2 μg/g）。所有實驗組的暴露劑量均處于亞慢性和現實相關范圍。
3.2 差異表達蛋白質
蛋白質組學分析揭示了顯著的性別差異和飲食干預效果。在不添加功能性成分的飼料組（對照組），暴露于AFB1和OTA導致大量腎臟蛋白質表達被抑制，雄性大鼠顯示出比雌性更強的敏感性，尤其是在OTA暴露下。維恩圖分析顯示，在非強化飼料組（亞組1），雄性共有140個共同DEPs，雌性有122個。補充FW（亞組2）后，雄性中153個共同DEPs的94%為上調表達，雌性中129個共同DEPs的80%為上調，表明FW顯著逆轉了毒素引起的蛋白質表達抑制。當聯合補充FW和P（亞組3）時，DEPs數量進一步減少，且雄性和雌性間的差異變小，表明FW+P組合提供了更強的保護作用，并能降低雄性對毒素誘導改變的敏感性�？偟膩碚f，AFB1和OTA聯合暴露引起了最顯著的蛋白質組改變，與單一毒素暴露相比表現出疊加或協同毒性。
3.3 DEPs的功能分析
基因本體分析顯示，在所有實驗組中，細胞質和細胞溶質是受影響蛋白質最多的細胞組分，而線粒體則始終是富集最顯著的細胞器。在生物學過程層面，對外源刺激的反應（即解毒過程）是受影響最顯著的過程。在分子功能層面，相同的蛋白質結合最為普遍。值得注意的是，在僅暴露于毒素的對照組中，與黃曲霉毒素分解代謝過程相關的蛋白質（如Gsta1, Gsta3）顯著上調，但在FW+P干預組中則未發生改變，提示補充劑可能通過預防毒性而無需強烈激活此特定解毒途徑。與腎臟發育相關的蛋白質（如Ass1, Gatm）在FW+P組中顯著上調，而在對照組中下調，表明功能性成分有助于維持或促進腎臟健康發育。與氧化應激和細胞氧化劑解毒相關的蛋白質在FW干預組中上調，但在FW+P組中保持穩定，說明FW+P的組合可能更有效地穩定了細胞的氧化還原狀態。
熱圖分析和PPI網絡進一步證實，毒素暴露主要擾亂了與氧化應激（如Sod1, Prdx）和能量代謝（如丙酮酸代謝）相關的網絡。FW補充增強了有氧呼吸、抗氧化防御（Sod1, Gpx3, Park7）和氧運輸（Hba1, Hbe1）相關基因的相互作用。FW+P則進一步調節了與分子伴侶活性（Atp5f1a, Hsp基因）和精氨酸生物合成（Otc, Ass1）相關的網絡，支持了其在維持蛋白質穩態和代謝平衡方面的作用。
Reactome通路富集分析表明，在所有比較組中，“代謝”都是最富集的通路。在對照組（毒素暴露 vs. 無毒素對照）中，氨基酸代謝和三羧酸（TCA）循環及呼吸電子傳遞通路顯著富集，表明毒素暴露嚴重干擾了中心代謝和線粒體能量產生。在FW干預組，細胞對應激的反應以及TCA循環和呼吸電子傳遞通路富集程度增加，提示FW增強了線粒體呼吸和應激適應機制。在FW+P干預組，除了代謝和應激反應通路外，活性氧（ROS）的解毒通路也顯著富集，直接將FW+P與改善的ROS處理能力聯系起來。
結論
本研究首次提供了AFB1和OTA引起腎臟功能改變的性別特異性蛋白質組學證據，揭示了其對解毒、能量代謝和應激反應通路的一致性破壞。雄性通常表現出更高的敏感性，尤其是對OTA。膳食補充發酵乳清（FW）和南瓜粉（P）能夠通過調節線粒體呼吸、增強抗氧化防御、維持氨基酸代謝和蛋白質穩態來減輕這些有害效應。FW和P聯合補充比單獨使用FW顯示出更強的保護效果，特別是在降低雄性敏感性方面。這些發現支持了FW和南瓜提取物作為功能性膳食成分在緩解霉菌毒素誘導的腎損傷方面的潛力，同時強調了在毒理學和營養干預研究中考慮性別差異的重要性。
