《The Journal of Physiology》：The sympathoregulatory region of the mouse rostral brainstem relies on both GABA and glycine to generate inhibitory currents
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本文聚焦小鼠延髓腹外側/腹內側區(qū)（VLM/VMM）交感前神經(jīng)元，揭示了這些神經(jīng)元接受來自甘氨酸能神經(jīng)元（表達甘氨酸轉運體2, GlyT2）的單突觸輸入，并協(xié)同釋放γ-氨基丁酸（GABA）與甘氨酸兩種抑制性遞質。研究通過光遺傳學刺激、膜片鉗記錄及病毒示蹤等技術，證實增強抑制性突觸活動可促進甘氨酸釋放，且持續(xù)性甘氨酸釋放依賴于GlyT2介導的甘氨酸攝取。同時，鑒定了甘氨酸能神經(jīng)元位于外側巨細胞旁核與B?tzinger復合體，并揭示了VLM/VMM神經(jīng)元中甘氨酸受體（GlyR）α1、α3與β亞基的表達模式。該研究闡明了GABA與甘氨酸在交感前神經(jīng)元調控中的必要性與協(xié)同作用，為理解交感神經(jīng)活動的基礎抑制性環(huán)路提供了新視角。
引言：中樞抑制性調控的基石
γ-氨基丁酸（GABA）與甘氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質，通過作用于離子型受體導致神經(jīng)元超極化，抑制其活動。越來越多的證據(jù)表明，在脊髓、背側耳蝸核、展神經(jīng)核以及延髓腹外側/腹內側區(qū)（VLM/VMM）等多個腦區(qū)，存在GABA與甘氨酸的協(xié)同釋放。交感前神經(jīng)元位于腹側腦干的VLM/VMM，它們向脊髓的交感節(jié)前神經(jīng)元傳遞信息，在調節(jié)交感神經(jīng)活動（SNA）中扮演關鍵角色。盡管甘氨酸能抑制在VLM/VMM交感前神經(jīng)元中已被觀察到，但其輸入來源與釋放機制尚不明確。本研究旨在探究VLM/VMM交感前神經(jīng)元是否接受甘氨酸能輸入，并闡明其釋放機制。
方法：多技術聯(lián)合的研究路徑
本研究采用多種神經(jīng)解剖學與電生理學方法。通過將GlyT2Cre小鼠與通道視紫紅質2（ChR2）小鼠雜交，獲得在GlyT2表達神經(jīng)元中特異性表達ChR2的GlyT2ChR2/EYFP小鼠。利用偽狂犬病毒（PRV-614）逆行標記VLM/VMM交感前神經(jīng)元，并在腦干切片上進行全細胞膜片鉗記錄。藥理學實驗使用荷包牡丹堿（bicuculline）和士的寧（strychnine）分別阻斷GABAA受體（GABAAR）與甘氨酸受體（GlyR）。使用4-氨基吡啶（4-AP）增強神經(jīng)元網(wǎng)絡興奮性，使用河豚毒素（TTX）鑒定單突觸連接，并使用GlyT2抑制劑ORG25543探究甘氨酸攝取的作用。此外，結合單突觸與跨突觸病毒追蹤技術定位甘氨酸能神經(jīng)元，并通過免疫熒光染色檢測VLM/VMM神經(jīng)元中GlyR α1、α3和β亞基的表達。
結果核心發(fā)現(xiàn)
1. 增強網(wǎng)絡活動促進甘氨酸釋放
對PRV標記的VLM/VMM交感前神經(jīng)元進行膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性抑制性突觸后電流（sIPSC）由GABA與甘氨酸共同介導。應用GABAAR阻斷劑荷包牡丹堿后，約60%的sIPSC電流（Iphasic）對荷包牡丹堿不敏感。在荷包牡丹堿存在下，應用鉀通道阻斷劑4-AP以增強網(wǎng)絡興奮性，顯著增加了sIPSC的頻率與Iphasic，而隨后應用的GlyR阻斷劑士的寧則能消除這些剩余的電流。這表明，增強抑制性突觸活動可促進甘氨酸的釋放。
2. 刺激GlyT2纖維觸發(fā)GABA與甘氨酸共釋放
光刺激GlyT2ChR2/EYFP纖維可在67%的記錄的VLM/VMM交感前神經(jīng)元中誘發(fā)出IPSC（eIPSC）。荷包牡丹堿可部分降低eIPSC的振幅與電荷轉移，而聯(lián)合應用荷包牡丹堿與士的寧則可完全阻斷eIPSC，證實光誘發(fā)的電流由GABA與甘氨酸共同產生。進一步應用GlyT2抑制劑ORG25543后，eIPSC的振幅與電荷轉移均顯著降低，表明GlyT2介導的甘氨酸攝取對于維持甘氨酸能神經(jīng)傳遞至關重要。
3. 甘氨酸能輸入為單突觸連接
應用TTX可完全阻斷光誘發(fā)的IPSC，而隨后在TTX存在下加入4-AP則可部分恢復IPSC，并伴有反應延遲的增加。這一經(jīng)典方法證實了GlyT2表達神經(jīng)元與VLM/VMM交感前神經(jīng)元之間存在單突觸連接。
4. GlyT2調控甘氨酸釋放的持續(xù)性
通過給予不同間隔時間（IPI）的光刺激脈沖序列，研究了甘氨酸能突觸的短時程可塑性。結果顯示，在50 ms的短IPI下，后續(xù)脈沖誘發(fā)的電流幅度相對于第一個脈沖（P1）出現(xiàn)顯著抑制，隨著IPI延長（如2000 ms），抑制程度減輕。這提示高頻刺激易導致可釋放囊泡池的耗竭。重要的是，在荷包牡丹堿存在下（即僅剩甘氨酸能成分），應用ORG25543抑制GlyT2后，不僅P1的幅度下降，后續(xù)脈沖與P1的比值（Pn/P1）也進一步降低，表明GlyT2的活性對于維持高頻刺激下甘氨酸的持續(xù)性釋放至關重要。2 reduces glycine release">
5. 甘氨酸能神經(jīng)元的定位與GlyR亞基表達
將逆向腺相關病毒pAAV-hSyn-DIO-EGFP注射到GlyT2Cre小鼠的VLM區(qū)，結合腎臟注射PRV-614進行示蹤，發(fā)現(xiàn)投射至VLM/VMM交感前神經(jīng)元的甘氨酸能神經(jīng)元主要位于腹側腦干，尤其是外側巨細胞旁核（LPGi）和B?tzinger復合體（Bo）。免疫熒光染色顯示，在VLM/VMM交感前神經(jīng)元中，GlyR α1亞基的免疫反應性呈點狀分布在神經(jīng)元突起周圍，α3亞基則彌漫性表達于胞體，β亞基亦有表達。這種差異分布提示α1與α3 GlyR可能分別位于樹突與胞體，介導不同空間位置的抑制性輸入。
討論：協(xié)同抑制的意義與展望
本研究證實，在腹側腦干，表達GlyT2的神經(jīng)元依賴GABAA受體與甘氨酸受體共同產生抑制性突觸后電流。VLM/VMM交感前神經(jīng)元的sIPSC由GABA與甘氨酸的突觸前釋放共同生成，且增強網(wǎng)絡活動會促進甘氨酸釋放。光遺傳學刺激甘氨酸能纖維可觸發(fā)兩種遞質的共釋放，且該輸入為單突觸連接。解剖學研究將甘氨酸能神經(jīng)元定位于腹側腦干的LPGi與Bo，并揭示了VLM/VMM神經(jīng)元中GlyR α1、α3和β亞基的表達模式。
GABA與甘氨酸的共釋放可能決定抑制的強度與時間特性。在聽覺腦干核團中，GABA可作為GlyR的共激動劑加速IPSC動力學。除了突觸后受體激活，這些遞質還可逆行作用于突觸前受體并影響囊泡內遞質的包裝。甘氨酸能神經(jīng)傳遞在協(xié)調呼吸運動輸出和形成正常呼吸模式中亦起關鍵作用。本研究之前的發(fā)現(xiàn)提示，在大鼠RVLM中阻斷GlyR會縮短血壓升高后腎交感神經(jīng)活動的恢復時間，這可能意味著GABA控制興奮性閾值，而甘氨酸則在突觸活動增強時增強抑制強度。
本研究的發(fā)現(xiàn)表明，GlyT2表達神經(jīng)元釋放GABA與甘氨酸以抑制VLM/VMM交感前神經(jīng)元。sIPSC的雙組分特性最可能的解釋是甘氨酸能中間神經(jīng)元囊泡內GABA與甘氨酸的量子化共釋放。在討論交感活動的基礎機制時，需考慮這種雙遞質釋放模式。GlyT2位于甘氨酸能神經(jīng)元的軸突末梢，對甘氨酸攝取貢獻巨大，其阻斷幾乎消除了GlyT2ChR2/EYFP表達神經(jīng)元在單次或連續(xù)光刺激下的甘氨酸釋放，凸顯了GlyT2在腹側腦干甘氨酸能神經(jīng)傳遞中的核心作用。
總之，該研究揭示了VLM/VMM區(qū)抑制性環(huán)路中GABA與甘氨酸協(xié)同作用的新機制，強調在理解交感前神經(jīng)元功能與交感輸出調控時，必須同時考慮這兩種抑制性神經(jīng)傳遞。這為未來探索相關神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如心血管調節(jié)異常、呼吸紊亂）的病理機制與潛在治療靶點提供了重要的理論基礎。
