肺炎克雷伯菌（Kp）已成為全球尤其是東亞地區化膿性肝臟膿腫的主要致病菌，其引發的侵襲性感染可導致腦膜炎、眼內炎、壞死性筋膜炎等轉移性并發癥，統稱為肺炎克雷伯菌侵襲綜合征（KPIS）。該綜合征的發生依賴于細菌和宿主兩方面的因素。在細菌層面，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）菌株，特別是血清型K1和K2，與KPIS的發生密切相關。在宿主層面，血糖控制不佳的糖尿病（DM）是KPIS最重要的風險因素。高血糖環境會促進hvKp莢膜多糖（CPS）基因表達，增強其抵抗吞噬的能力，并削弱中性粒細胞的趨化、吞噬和殺菌功能，從而增加侵襲性疾病的風險。此外，血小板除了止血功能外，也被認為是感染和炎癥的重要介質。它們與免疫細胞相互作用，形成血小板-白細胞聚集體（PLA），這些聚集體既參與宿主防御，也可能導致血栓形成。研究表明，糖尿病患者循環中PLA水平升高，與血管并發癥相關。鑒于血小板活化、炎癥和血栓形成在KPIS中的相互作用，抗血小板治療（如使用阿司匹林）已被提出作為一種潛在的治療策略，回顧性研究也顯示阿司匹林可降低化膿性肝臟膿腫的發生率和復發率。然而，血小板活化、PLA形成與KPIS發病機制之間的聯系，以及阿司匹林在其中所起的作用，尚未完全闡明。本研究旨在明確高血糖條件下，血小板-白細胞（特別是中性粒細胞）相互作用對KPIS的貢獻，并評估阿司匹林調控這些作用的潛力。

研究獲得了長庚紀念醫院機構審查委員會（IRB）的批準。使用的細菌菌株包括從肝膿腫患者分離的具有高黏液表型的hvKp菌株KP-M1（ST23，血清型K1）及其衍生的無莢膜突變體DT-X。從健康志愿者采集全血樣本，分別用于血小板活化、PNA分析和中性粒細胞分離。血小板活化通過流式細胞術檢測CD61和CD62P（P-選擇素）的表達進行評估，同時使用ELISA試劑盒定量血漿中的可溶性活化標志物（P-選擇素、血小板因子4（PF-4）和β-血栓球蛋白（β-TG/NAP-2））。PNA形成通過流式細胞術檢測CD42b⁺/CD11b⁺/CD18⁺三重陽性事件來評估，并使用吉姆薩染色進行顯微鏡觀察。中性粒細胞殺菌活性通過菌落形成單位（CFU）計數來評估KP-M1的存活情況。動物實驗使用C57BL/6（B6）小鼠，通過注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病。治療組小鼠每日口服阿司匹林，對照組給予無菌水。隨后通過口服灌胃感染KP-M1。感染后監測生存情況，并收集血漿和組織樣本進行分析，包括血漿P-選擇素ELISA、組織H&E染色評估損傷以及肝臟勻漿CFU計數以確定細菌負荷。所有數據均使用適當的統計方法進行分析。

流式細胞術分析表明，與無莢膜對照菌株DT-X和DPBS對照相比，KP-M1孵育顯著增加了血小板活化（CD61⁺/CD62P⁺比例升高），并且這種效應在所有測試的葡萄糖濃度下均能觀察到。葡萄糖補充進一步以濃度依賴性的方式增強了KP-M1誘導的血小板活化，在0.5%葡萄糖濃度下達到最高。相反，在沒有KP-M1的情況下，葡萄糖補充本身并未顯著增加血小板活化。顯微鏡觀察結果與流式結果一致，顯示KP-M1處理后血小板聚集和活化形態特征在高葡萄糖濃度下更為明顯。

與血小板活化并行，KP-M1孵育也顯著促進了PNA的形成，表現為CD42b⁺/CD11b⁺/CD18⁺事件比例增加。這種效應是KP-M1特異的，DT-X或DPBS對照在任何葡萄糖條件下均未誘導出可比水平的PNA形成。葡萄糖補充進一步以濃度依賴性的方式增強了KP-M1誘導的PNA形成，在0.5%葡萄糖下達到最高水平。顯微鏡檢查也證實了KP-M1暴露后血小板-中性粒細胞相互作用的增強。

水楊酸（SA，阿司匹林的活性成分）被測試其對KP-M1介導的血小板活化的影響。流式細胞術顯示，在0.5%葡萄糖的高血糖條件下，添加30 μg/mL SA顯著降低了CD61⁺/CD62P⁺血小板比例以及P-選擇素、PF-4和β-TG等活化標志物水平，表明SA有效降低了高血糖條件下KP-M1誘導的血小板過度活化。然而，盡管降低了血小板活化，SA并未減少在0.5%葡萄糖條件下的PNA形成。CFU實驗表明，添加SA顯著降低了在0.5%葡萄糖中KP-M1的存活數量，提示SA增強了中性粒細胞介導的細菌清除能力。

在糖尿病小鼠模型中，KP-M1感染后血漿P-選擇素（CD62P）水平顯著升高，而阿司匹林預處理降低了這一水平，表明其能減輕感染后的血小板活化。生存分析顯示，KP-M1感染顯著降低了正常血糖和糖尿病小鼠的生存率，而阿司匹林預處理延長了生存時間，在糖尿病組中效果具有統計學顯著性。感染糖尿病小鼠的死后檢查顯示肝臟和肺部有廣泛的膿腫，而阿司匹林處理的糖尿病小鼠則未出現肉眼可見的膿腫，表明其對組織損傷具有保護作用。肝臟組織病理學也證實了阿司匹林預處理能更好地保護肝臟結構，半定量評分顯示其顯著降低了感染引起的肝損傷。此外，肝臟勻漿CFU計數顯示，未使用阿司匹林的感染糖尿病小鼠細菌負荷最高，而阿司匹林預處理顯著降低了正常血糖和糖尿病小鼠的肝臟細菌負荷。

本研究探討了高血糖條件下KPIS中的血小板-中性粒細胞相互作用，并評估了阿司匹林調節hvKp感染的治療潛力。高血糖會加劇hvKp誘導的血小板活化、增加PNA形成并促進細菌存活，表明高血糖加劇了hvKp驅動的免疫失調并促進KPIS。血小板除了參與止血，還在炎癥和感染反應中扮演更廣泛的角色，它們與中性粒細胞相互作用形成PNA，這些聚集體可能通過促進內皮黏附、產生活性氧和形成中性粒細胞胞外陷阱（NETs）來捕獲病原體，但也可能導致組織損傷和血栓形成。這與先前觀察到的KPIS患者，特別是血糖控制不佳者，血栓并發癥風險增加的現象一致。

阿司匹林對血小板活化的抑制作用已很明確，但其對PNA形成的影響更為復雜。本研究發現SA雖然降低了血小板活化標志物，但并未減少高血糖條件下的PNA形成，這表明阿司匹林可能直接影響PNA內的中性粒細胞活性，而非僅通過血小板起作用。這揭示了血小板-中性粒細胞相互作用在免疫和病理中的雙重作用。盡管如此，阿司匹林在體外和體內均顯示出增強中性粒細胞活性、降低細菌負荷、改善糖尿病小鼠生存率以及減輕器官損傷的效果。

研究建立的高血糖體外模型成功再現了hvKp感染的關鍵方面，為機制研究提供了可重復的平臺。而采用口服灌胃感染的糖尿病小鼠模型，則更好地模擬了臨床相關感染途徑，重現了KPIS的多器官受累特征。

本研究也存在一些局限性。例如，SA未能抑制PNA形成，其具體機制尚不清楚。研究僅評估了阿司匹林，未涉及其他抗血小板藥物。此外，未進行評估阿司匹林反應性的花生四烯酸刺激試驗。可溶性P-選擇素并非完全血小板特異性，但β-TG、PF4和可溶性P-選擇素結果一致，支持了血小板活化增強的結論。

本研究證明hvKp能顯著增加血小板活化和PNA形成，而高血糖會進一步放大這些效應。阿司匹林的應用降低了血小板活化、減少了細菌存活率，并改善了hvKp感染糖尿病小鼠的生存率。這些結果突顯了高血糖、血小板活化和免疫失調在KPIS中的緊密聯系，并支持阿司匹林作為一種潛在的輔助療法，用于減輕hvKp感染中的血栓炎癥并發癥。