結核病（TB）作為由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的慢性傳染病，依然是全球最致命的單一致病菌相關疾病。目前唯一獲批的百年老疫苗卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）雖然在兒童中具有較強保護效力，但在青少年及成人中的效果差異巨大（0% - 80%），且重復接種無法增強保護力，其對全球結核病流行的控制效果有限。因此，開發新的結核病疫苗策略至關重要。肺泡巨噬細胞（Alveolar macrophages, AMs）是肺部抵御吸入性病原體的第一道防線，其功能狀態對早期感染結局具有決定性作用。近年來，“訓練免疫”概念的提出表明，先天免疫細胞也能在刺激下形成長期的功能性重編程，從而在面對二次感染時產生更強更快的保護性反應。基于此，本研究團隊將目光投向了能夠誘導巨噬細胞先天免疫記憶的結核分枝桿菌抗原Rv1471，并利用能夠誘導肺泡巨噬細胞自主記憶的黑猩猩腺病毒載體，開發了一種新型鼻內黏膜疫苗rAd-Rv1471，旨在同時激活肺泡巨噬細胞的訓練免疫和適應性T細胞免疫，實現對結核病的協同防御。

研究團隊將結核分枝桿菌H37Rv菌株的抗原基因Rv1471克隆至復制缺陷型黑猩猩腺病毒26型載體中，構建了重組腺病毒疫苗rAd-Rv1471。通過桑格測序驗證了重組腺病毒的正確組裝。在HEK 293A細胞中包裝并純化病毒后，利用抗Rv1471血清進行Western Blot分析，證實了重組病毒能夠有效表達Rv1471蛋白。此外，還通過SWISS-MODEL服務器預測了Rv1471蛋白的三維結構，為后續功能研究提供了結構基礎。

為了評估rAd-Rv1471誘導訓練免疫的能力，研究建立了小鼠體內訓練免疫模型。小鼠經鼻內接種PBS、空白腺病毒載體（Ad）或rAd-Rv1471，28天后分離肺泡巨噬細胞進行功能分析。

實驗結果表明，與PBS組相比，Ad載體本身就能誘導肺泡巨噬細胞產生一定程度的訓練免疫，表現為在熱滅活結核分枝桿菌或脂多糖刺激下，促炎細胞因子TNF-α和IL-6的分泌顯著增強。而接種rAd-Rv1471則能進一步放大這種效應，使TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平顯著高于Ad組。

流式細胞術分析顯示，rAd-Rv1471訓練后的肺泡巨噬細胞表面MHC II分子和共刺激分子CD86的表達上調，細胞增殖標志物Ki67的表達也增加，表明細胞處于一種激活和準備狀態。同時，細胞內TNF-α和IL-6的分泌水平也顯著升高。單細胞層面的UMAP降維分析進一步確認，rAd-Rv1471訓練組的肺泡巨噬細胞中，高表達MHC II和TNF-α的細胞亞群比例顯著增加。

重要的是，研究人員構建了表達另一個結核分枝桿菌抗原Rv2299c的對照腺病毒rAd-Rv2299c，發現其并不能像rAd-Rv1471那樣增強肺泡巨噬細胞的訓練免疫反應，這凸顯了Rv1471抗原在誘導訓練免疫方面的特異性。

為了探究rAd-Rv1471誘導的訓練免疫是否依賴于其他免疫細胞，研究建立了體外肺泡巨噬細胞訓練免疫評價模型。從初始小鼠中分離肺泡巨噬細胞并在體外擴增，然后用PBS、Ad或rAd-Rv1471進行訓練。

結果顯示，體外訓練的結果與體內實驗一致：rAd-Rv1471訓練能顯著增強肺泡巨噬細胞在HK Mtb或LPS再刺激下TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。轉錄組測序分析表明，rAd-Rv1471訓練后的肺泡巨噬細胞中，編碼炎癥細胞因子、趨化因子以及抗原呈遞和吞噬相關關鍵分子的基因表達上調。

最關鍵的功能性實驗證明，與未訓練的對照組相比，經Ad訓練的肺泡巨噬細胞對活BCG和結核分枝桿菌的細胞內清除能力在感染后48小時顯著增強。而rAd-Rv1471訓練則能帶來更高水平的細菌清除效果。通過感染表達綠色熒光蛋白的BCG并觀察熒光強度，也直觀地證實了rAd-Rv1471訓練組肺泡巨噬細胞內細菌負荷的降低。這些數據表明，rAd-Rv1471通過訓練免疫，以不依賴于其他細胞的方式，增強了肺泡巨噬細胞自主的內在抗分枝桿菌防御能力。

為了闡明rAd-Rv1471誘導訓練免疫的分子機制，研究人員對體外訓練后靜息5天的肺泡巨噬細胞進行了Smart-seq2 RNA測序。

主坐標分析顯示，不同訓練組的肺泡巨噬細胞具有截然不同的轉錄譜。基因本體生物過程富集分析表明，rAd-Rv1471訓練組上調的基因通路主要與刺激反應和先天免疫反應過程相關。京都基因與基因組百科全書通路分析進一步揭示了經典炎癥信號通路的顯著富集，如ErbB、TGF-β、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB和TNF信號通路，以及與先天免疫反應相關的通路，如白細胞跨內皮遷移、Toll樣受體信號、NOD樣受體信號、趨化因子信號和C型凝集素受體信號通路。

尤為關鍵的是，與巨噬細胞訓練免疫誘導密切相關的通路，如糖酵解和Akt/mTOR/HIF-1α信號通路，在Ad和rAd-Rv1471組中均被顯著激活。其中，rAd-Rv1471組在Akt/mTOR/HIF-1α信號通路上的激活水平顯著高于Ad組。通過Seahorse能量代謝分析儀進行的代謝譜分析也證實，rAd-Rv1471和Ad對增強糖酵解活性具有相似的效果。定量PCR進一步驗證了RNA測序的結果，Tnfα、Il6、Il1b、Mtor、Akt、Nfκb、Hif1α和Nod1等關鍵基因的表達在rAd-Rv1471組均顯著上調。

綜上所述，這些結果表明rAd-Rv1471通過轉錄重編程，在肺泡巨噬細胞中建立了一種訓練狀態，增強了其對二次挑戰的免疫代謝反應。

研究進一步評估了rAd-Rv1471作為疫苗在小鼠模型中的免疫原性。小鼠經鼻內接種后第28天，分析肺和脾臟中的T細胞反應。

流式細胞術分析發現，與PBS和Ad對照組相比，rAd-Rv1471疫苗接種顯著增加了肺部和脾臟中Rv1471特異性Th1和Th17 CD4? T細胞以及細胞毒性CD8? T細胞亞群的頻率。在Rv1471或HK Mtb刺激下，這些T細胞亞群分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-17的能力也顯著增強。

多功能性分析進一步證明，在rAd-Rv1471免疫的小鼠肺部，雙陽性（如TNF-α?IL-2?、TNF-α?IL-17?、IFN-γ?IL-17?）和單陽性（TNF-α?、IFN-γ?、IL-2?、IL-17?）的CD4? T細胞亞群比例擴大。CD8? T細胞也顯示出類似的多功能性比例增加。這些發現表明，rAd-Rv1471疫苗能在小鼠疫苗接種模型中引發強大的抗原特異性多功能性T細胞反應。

為直接評估疫苗的保護效力，免疫后4周的小鼠通過氣溶膠感染結核分枝桿菌。

結果顯示，與僅接種Ad載體的小鼠相比，接種rAd-Rv1471的小鼠肺部和脾臟中的細菌負荷顯著降低。Ad載體本身僅能略微降低脾臟的細菌負荷。肺組織病理學分析表明，rAd-Rv1471免疫顯著改善了感染引起的炎癥病理變化，如淋巴細胞、巨噬細胞和粒細胞浸潤、肺泡壁增厚和出血灶等。對炎癥浸潤面積的定量評估進一步支持了rAd-Rv1471的保護作用。

考慮到BCG在成人中復種效果有限，研究還評估了rAd-Rv1471作為BCG初免后的異源加強針的效果。與僅接種BCG的小鼠相比，BCG初免后再用rAd-Rv1471加強免疫，能在結核分枝桿菌攻擊后進一步降低細菌負荷。盡管在減輕炎癥浸潤方面也觀察到改善趨勢，但與單獨BCG組相比未達到統計學顯著性。

綜上所述，這些結果表明rAd-Rv1471既能作為獨立的疫苗，也能作為BCG的加強針，有效增強小鼠的抗結核保護。

研究評估了結核分枝桿菌攻擊后的回憶性免疫。結果顯示，與對照組相比，rAd-Rv1471免疫的小鼠在PPD刺激下，其肺來源的CD4?和CD8? T細胞產生TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-17的水平均升高。

多功能性分析顯示，雙陽性CD4? T細胞亞群（TNF-α?IFN-γ?、TNF-α?IL-2?、IFN-γ?IL-2?）和單陽性亞群（TNF-α?、IFN-γ?、IL-2?）的比例擴大，CD8? T細胞中也觀察到相應的雙陽性和單陽性亞群增加。此外，感染后rAd-Rv1471免疫組肺中CD4?和CD8? T細胞的比例顯著增加。表型分析發現，rAd-Rv1471訓練與中央記憶T細胞比例減少、效應記憶T細胞、終末分化效應記憶T細胞和初始T細胞亞群比例增加相關。

因此，研究人員推測，rAd-Rv1471可能通過促使T細胞優先分化為效應表型，從而為肺部T細胞快速、多功能性的抗結核分枝桿菌回憶應答做好了準備。

本研究首次將能夠誘導訓練免疫的結核分枝桿菌抗原Rv1471與能夠靶向肺部并誘導肺泡巨噬細胞自主記憶的黑猩猩腺病毒載體相結合，開發了新型黏膜疫苗rAd-Rv1471。該疫苗成功地在肺泡巨噬細胞中誘導了強大的訓練免疫狀態，其特征是促炎細胞因子分泌增強、抗原呈遞能力提升以及細胞自主抗分枝桿菌活性提高。同時，它還引發了強烈的抗原特異性多功能性T細胞應答。

與空白腺病毒載體相比，rAd-Rv1471顯著放大了訓練免疫表型。然而，單獨激活肺泡巨噬細胞并不足以對抗像結核分枝桿菌這樣復雜的病原體。控制早期結核分枝桿菌感染需要肺泡巨噬細胞與組織駐留抗原特異性T細胞免疫反應之間的相互作用。本研究支持一個時空協同模型：鼻內接種rAd-Rv1471疫苗，能在感染的首要門戶——肺部，快速建立肺泡巨噬細胞的“訓練警戒”狀態，增強早期細菌控制；同時，它在肺部播下抗原特異性、多功能性記憶T細胞的種子。當遭遇結核分枝桿菌攻擊時，這些訓練后的肺泡巨噬細胞能更有效地處理和呈遞抗原，從而加速共存T細胞庫的再激活。這種協調的雙層反應為觀察到的卓越保護力提供了合理的機制解釋。

本研究的策略相較于其他疫苗平臺具有獨特優勢。黏膜接種的腺病毒載體能直接靶向肺部駐留的先天免疫細胞，建立高度警戒狀態。與主要通過系統遞送刺激適應性免疫的佐劑蛋白亞單位疫苗相比，該策略能實現更快速的應答。此外，與mRNA或其他核酸平臺相比，病毒載體已被證明能更有效地觸發髓系細胞中持久訓練免疫所特有的代謝和表觀遺傳重編程。

考慮到新生兒BCG疫苗接種已在大多數結核病高負擔國家實施，rAd-Rv1471最具戰略意義的應用是作為異源黏膜加強針。這種方法直接針對BCG在青少年和成人中效力不一的局限性，通過特異性增強肺部駐留的訓練免疫和T細胞記憶來提升保護。因此，該平臺并非旨在取代BCG，而是增強它，為高風險人群提供針對性的保護策略。

當然，本研究也存在一些局限性。首先，小鼠模型無法完全模擬人類結核病的免疫和病理復雜性。其次，雖然rAd-Rv1471可能協同肺泡巨噬細胞和T細胞記憶，但這種相互作用需要通過共培養系統或過繼轉移模型進一步驗證。第三，將rAd-Rv1471與免疫優勢結核分枝桿菌抗原（如ESAT-6、TB10.4、Ag85A/B）組合成多價疫苗，可能通過共同激活訓練免疫和適應性免疫來擴大保護范圍。

總之，本研究將rAd-Rv1471確立為一種整合肺泡巨噬細胞訓練與多功能性T細胞應答的雙靶向疫苗，為結核病控制提供了一種協同策略。這些發現強調了將肺泡巨噬細胞訓練免疫納入下一代疫苗理性設計的轉化潛力。

研究詳細描述了重組腺病毒的構建、肺泡巨噬細胞的分離與純化、體內外訓練免疫模型的建立、酶聯免疫吸附試驗、肺泡巨噬細胞抗分枝桿菌活性評估、小鼠體內保護效力評估、單細胞懸液制備、組織病理學染色、流式細胞術、糖酵解速率測定、定量PCR、Smart-RNA測序以及統計學分析等實驗方法。所有動物實驗均遵循上海公共衛生臨床中心實驗動物倫理委員會的指南并獲得批準。本研究得到了多項國家及地方科研基金的資助。