為確認豬鏈球菌2型(SS2)感染可破壞呼吸道上皮屏障，研究首先建立了小鼠鼻內攻毒模型。與對照組相比，SS2感染組小鼠的氣管和肺部出現嚴重病理損傷，并在氣管、肺部和血液中檢測到更高的細菌載量。組織病理學分析證實了顯著的屏障損傷，包括氣管上皮纖毛斷裂、剝脫以及肺泡塌陷、炎性細胞浸潤。這些結構性損傷伴隨著小鼠氣管上皮中細胞連接蛋白E-cadherin和Occludin在蛋白和mRNA水平上的顯著減少，表明細胞旁通透性增加。這些發現與在SS2感染的仔豬模型中的觀察結果一致，證明了該致病機制的跨物種相關性。

為在細胞水平上進一步研究此現象，研究人員采用了極化的豬呼吸道上皮細胞(NPTr)體外模型。SS2感染導致了跨上皮電阻(TEER)呈感染復數(MOI)依賴性的下降。時序分析進一步揭示了E-cadherin和Occludin在轉錄和翻譯水平上的進行性丟失。來自多個模型的這些發現共同證明，SS2感染通過拆解關鍵的細胞間連接蛋白，損害了呼吸道上皮屏障的完整性，從而促進了細菌的入侵和播散。

在確認SS2破壞上皮屏障后，研究進一步探究了其細胞死亡機制，假設鐵死亡在其中發揮作用。研究人員發現，SS2感染NPTr細胞可誘導典型的鐵死亡形態學改變，包括完整的核膜且無出泡現象，這與經典的鐵死亡誘導劑RSL3處理后的細胞形態相似。SS2感染誘導了顯著的細胞毒性，并伴隨著細胞內Fe²⁺水平的相應升高。鐵死亡的一個關鍵驅動因素是鐵依賴的脂質過氧化。相應地，經SS2刺激的細胞顯示出活性氧(ROS)的顯著積累，以及明顯的脂質過氧化。此外，SS2感染導致典型的鐵死亡生物標志物丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)水平顯著增加，達到與RSL3處理相當的水平。透射電子顯微鏡超微結構分析揭示了線粒體空泡化和嵴的消失，這些都是鐵死亡的特征性表現。這些數據綜合證明，SS2感染是呼吸道上皮細胞鐵死亡的有效誘導劑。

為確認鐵死亡在SS2介導的細胞毒性和屏障功能障礙中的因果作用，研究使用了特異性鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 (Fer-1)。Fer-1與SS2共處理有效地挽救了受感染的NPTr細胞免于死亡。這種保護作用與細胞內Fe²⁺水平的顯著降低以及脂質過氧化標志物MDA和4-HNE的明顯抑制相關。與此一致，Fer-1處理保留了質膜完整性，表現為碘化丙啶(PI)攝入的減少。

研究隨后探討了抑制鐵死亡是否能挽救SS2誘導的上皮屏障完整性喪失。事實上，Fer-1處理顯著減輕了SS2誘導的E-cadherin和Occludin在mRNA和蛋白水平的下調。在功能上，Fer-1與SS2共處理顯著減弱了因感染導致的TEER下降，證明屏障功能得以保留。此外，鐵死亡的藥理學抑制顯著限制了SS2的增殖能力。這些發現建立了SS2誘導的鐵死亡與呼吸道上皮屏障破壞之間的直接聯系。

在鐵死亡過程中，脂質過氧化將膜脂轉化為一系列活性醛類副產物，其中4-HNE和MDA是研究最為廣泛的。這些化合物導致并放大了與鐵死亡相關的下游生物學后果。鑒于抑制鐵死亡能夠挽救屏障功能，研究人員假設鐵死亡標志性的脂質過氧化物積累是連接蛋白降解的原因。為驗證此假設，研究人員直接用脂質過氧化的主要產物4-HNE處理NPTr細胞。僅此處理就足以導致TEER顯著下降以及E-cadherin和Occludin mRNA水平的相應降低。通過Western blot和免疫熒光實驗在蛋白水平上確認了這些連接蛋白的減少，表明脂質過氧化產物可以通過下調連接蛋白表達直接損害屏障完整性。

鋅指轉錄因子Snail1是已知的上皮連接蛋白抑制因子。研究人員觀察到，4-HNE處理導致NPTr細胞中Snail1的顯著上調和核定位。為直接驗證Snail1在此過程中的作用，研究構建了Snail1敲除(KO)的NPTr細胞系。關鍵的是，與野生型(WT)細胞相比，Snail1-KO細胞在SS2誘導的E-cadherin和Occludin的mRNA和蛋白水平下調方面受到顯著保護。這種保護作用轉化為屏障功能的顯著保留，表現為受感染的Snail1-KO細胞具有更高的TEER值。這些結果共同勾勒出一個機制：SS2誘導的脂質過氧化產物（如4-HNE）上調轉錄抑制因子Snail1。隨后，Snail1介導連接蛋白表達下調，導致上皮屏障的瓦解。

為闡明SS2誘導鐵死亡的分子機制，研究人員對SS2感染的NPTr細胞進行了RNA測序(RNA-seq)。KEGG通路分析顯示，差異表達基因在粘附連接、緊密連接和鐵死亡等相關通路上顯著富集。具體在鐵死亡通路內，研究人員觀察到宿主關鍵抗氧化基因（包括Gpx4、Slc7a11、Gclc和Gclm）的顯著下調。研究驗證了這些發現，確認SS2感染導致Gpx4和Slc7a11的mRNA和蛋白水平隨時間依賴性下降，以及細胞谷胱甘肽(GSH)水平的減少。

Nrf2是細胞抗氧化防御系統的主調控因子。有趣的是，雖然SS2感染后Nrf2的mRNA水平沒有變化，但其蛋白水平顯著降低，提示存在轉錄后調控。為明確降解途徑，研究人員用蛋白酶體抑制劑(MG132)或溶酶體抑制劑(氯喹)處理受感染細胞。MG132（而非氯喹）恢復了Nrf2蛋白水平，表明泛素-蛋白酶體系統參與了其降解。隨后的免疫共沉淀實驗證實，SS2感染顯著增加了Nrf2的泛素化。

為功能上將Nrf2降解與鐵死亡表型聯系起來，研究顯示，用MG132阻斷蛋白酶體降解不僅能穩定Nrf2，還能恢復其下游靶點Gpx4和Slc7a11的表達�？寡趸�反應的恢復導致SS2感染細胞內GSH水平增加，并顯著抑制了脂質過氧化。這些數據共同證明，SS2通過促進Nrf2的泛素-蛋白酶體依賴的降解，瓦解了細胞的抗氧化防御系統，從而使上皮細胞對鐵死亡敏感化。

為確定SS2中介導鐵死亡的毒力因子，研究人員篩選了11種主要毒力因子，檢測它們使NPTr細胞對RSL3誘導的脂質過氧化（鐵死亡的既定標志物）敏感化的能力。真核樣絲/蘇氨酸激酶1(Stk1)和豬溶素(Sly)蛋白的過表達導致了最高的脂質ROS水平和細胞死亡�；�于此前關于細菌絲/蘇氨酸激酶參與宿主泛素化途徑的報道，研究人員將Stk1作為介導Nrf2降解的主要候選因子。

構建SS2的Stk1基因缺失突變體ΔStk1及其回補菌株CΔStk1，以研究Stk1在SS2感染NPTr細胞過程中Nrf2泛素化介導降解的作用。使用SS2野生型(WT)、ΔStk1和CΔStk1菌株的實驗證實，Stk1對于SS2誘導的Nrf2蛋白降解以及隨后Nrf2泛素化的增加是必不可少的。由于免疫共沉淀實驗顯示Stk1與Nrf2之間沒有直接相互作用，研究人員假設Stk1通過中間介質發揮作用。研究人員將注意力轉向了Keap1，它是靶向Nrf2進行降解的Cul3-E3泛素連接酶復合物的底物接頭蛋白。Keap1-Nrf2軸也參與鐵死亡的調控。免疫共沉淀和免疫熒光實驗證明，Stk1直接與Keap1相互作用并在細胞質中共定位。至關重要的是，Stk1的共表達增強了Keap1與Nrf2之間的相互作用，并促進了Nrf2的泛素化。這些發現共同表明，SS2感染促進了Stk1與Keap1的相互作用，從而穩定了Keap1-Nrf2復合物。這種穩定促進了Nrf2的泛素化及隨后的降解。

為明確確立Keap1-Nrf2軸在此過程中的作用，研究人員利用CRISPR/Cas9系統構建了Keap1敲除(KO)的NPTr細胞系。在Keap1-KO細胞中，無論Stk1是否存在，SS2感染都減輕了誘導的Nrf2降解。因此，與Keap1-WT細胞相比，Keap1-KO細胞受到保護，免受SS2誘導的鐵死亡影響，表現出顯著更低的脂質ROS、MDA和4-HNE水平，以及更少的細胞死亡。這些發現表明，SS2效應蛋白Stk1劫持了宿主Keap1-Nrf2軸，通過與Keap1相互作用以穩定其與Nrf2的結合，從而促進Nrf2的泛素化和降解，觸發上皮細胞鐵死亡。

最后，為驗證Stk1-鐵死亡軸的生理相關性，研究人員利用了小鼠感染模型。與體外數據一致，與感染ΔStk1突變體的小鼠相比，感染SS2野生型或回補菌株(CΔStk1)的小鼠表現出更嚴重的氣管上皮和肺部病理損傷，并支持更高的細菌載量。在分子水平上，來自野生型和CΔStk1感染小鼠的氣管組織顯示出4-HNE染色升高，Nrf2蛋白水平顯著降低（盡管mRNA水平未變），以及Nrf2靶點Slc7a11和Gpx4的顯著下調。

至關重要的是，用鐵死亡抑制劑Fer-1處理在很大程度上逆轉了感染SS2野生型小鼠的這些效應，恢復了Nrf2蛋白水平和抗氧化基因表達，同時降低了脂質過氧化。這種干預也保護了屏障完整性，表現為E-cadherin和Occludin的表達得以保留。這些體內結果證實，Stk1是一個關鍵的毒力因子，它通過觸發鐵死亡來瓦解呼吸道上皮屏障，從而促進細菌入侵和全身性播散。

綜上所述，本研究揭示了豬鏈球菌破壞宿主呼吸道上皮屏障的精密毒力機制。研究人員提出了一個模型：細菌效應蛋白Stk1與宿主蛋白Keap1相互作用，從而增強核心抗氧化調控因子Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解。由此導致的細胞抗氧化防御系統崩潰使上皮細胞對鐵死亡敏感，導致4-HNE等脂質過氧化物積累。這些脂質醛類物質進而驅動轉錄抑制因子Snail1上調，從而抑制關鍵的粘附連接和緊密連接蛋白表達。這一級聯反應最終導致上皮完整性喪失、細胞旁通透性增加，并最終促進細菌入侵和全身性播散。