《Animal Cells and Systems》：Notch signaling in leech neurogenesis: expression patterns and functional insights in the Glossiphoniid leech Helobdella austinensis
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本研究聚焦于軟體動物門環節動物的神經發育機制，通過系統解析水蛭Helobdella austinensis中Notch信號通路核心基因的表達圖譜及功能，揭示了其在體節形成與神經分化中的關鍵作用。文章在H. austinensis全基因組數據中鑒定出Notch通路成分，通過熒光原位雜交繪制了從胚胎第8至11期的時空表達模式，并利用γ-分泌酶抑制劑DAPT進行功能干擾，證明Notch信號缺失會破壞神經索形成并下調轉錄因子表達。此項工作為理解雙側對稱動物神經發育的進化保守機制提供了重要證據。
引言
細胞間通訊是多細胞生物發育與維持的基礎，Notch信號通路是其中最進化保守的通路之一，在相鄰細胞的近分泌信號傳導中扮演著核心角色。該通路在果蠅、線蟲及脊椎動物等模式生物中的功能已被廣泛研究，但在冠輪動物中的認知仍十分有限。水蛭作為環節動物的代表，缺乏體表剛毛，并具有前后吸盤的特征性器官，其胚胎發育過程，特別是體節化和神經發生機制，是研究進化發育生物學的良好模型。隨著Helobdella austinensis全基因組的測序完成，為深入研究該物種的Notch信號通路提供了可能。
材料與方法
研究使用在忠北大學再生與進化發育實驗室飼養的H. austinensis胚胎。從全基因組數據中鑒定出Notch通路的核心成分，包括受體基因Hau-notch1與Hau-notch2、配體基因Hau-delta與Hau-jagged，以及轉錄因子基因Hau-hes與Hau-hey。通過系統發育分析和結構域組成分析驗證了這些基因的同源性及功能結構域的保守性。利用原位雜交技術描繪了這些基因在胚胎第8至11期的時空表達圖譜。為探究Notch信號的功能，在胚胎第7期使用γ-分泌酶抑制劑DAPT進行處理，并通過免疫熒光染色評估其對腹神經索發育的影響，同時利用定量PCR檢測下游轉錄因子表達水平的變化。
結果
Notch信號通路基因的鑒定與系統發育分析
研究在H. austinensis中鑒定出兩個Notch受體、一個Delta、一個Jagged、一個Hey及三個Hes基因。本研究重點分析了Hau-notch1、Hau-delta、Hau-jagged、Hau-hes和Hau-hey。結構域分析顯示，Hau-Notch1和Hau-Notch2含有典型的EGF重復序列、LNR結構域及ANK重復序列等。配體蛋白含有MNLL和DSL結構域，轉錄因子則包含bHLH和Orange結構域。系統發育分析證實了這些成分在后生動物中的保守性。
胚胎外包期Notch成分在前部細胞簇的特異性表達
在胚胎第8期早期，Hau-notch1、Hau-delta和Hau-jagged在體節前體細胞中表達，并在前部細胞簇中表達更強。到第8期中期，這些基因的表達沿生發板持續。下游轉錄因子Hau-hes和Hau-hey則表現出不同的表達模式：Hau-hes在融合的生發板中少量細胞表達，而Hau-hey在左右生發帶前部的成對細胞中表達。雙熒光原位雜交結果顯示，Notch配體與受體在生發板前部細胞簇中共表達，甚至在相鄰細胞中存在重疊信號，提示細胞間相互作用的可能性。
器官發生期Notch成分在體節-神經節及多部位的表達
在第9至11期的器官發生階段，Notch成分的表達呈現出更復雜和特異的模式。第9期，Hau-notch1在原口和內臟前體中表達，同時在腹生發板表達。在吻部外翻和回縮階段，其在前吸盤前體、內臟肌肉、腹神經節及后吸盤前體中均有強烈表達。第11期，Hau-notch1轉錄本在口器、前后吸盤、腸道邊界以及每個體節神經節的神經纖維網膠質細胞和根神經細胞中被檢測到。
配體Hau-jagged的表達模式與Hau-notch1相似，在第9期于原口和生發板推測的外胚層譜系中表達，隨后在吻腔、內臟肌肉及吸盤前體中強烈表達。第11期，Hau-jagged在全身體節呈現“鹽和胡椒”式的點狀表達，并在神經節的側包和推測的Retzius細胞中表達。另一配體Hau-delta的表達模式與Hau-jagged類似，也在食道、腸道邊界、吸盤及神經細胞中表達。
轉錄因子Hau-hes在第9期僅在內臟肌肉中表達，但在第10至11期，在發育中的吻部、吸盤、內臟肌肉及體側出現點狀表達，這些點狀表達可能與感覺細胞相關。而Hau-hey的表達則隨時間推移從生發板向后部減弱，最終在第11期限定于后吸盤表達。
抑制Notch信號導致神經節發生過程中的神經退化
為探究Notch信號在神經系統發育中的功能，研究使用DAPT抑制該通路。在陰性對照中，每個體節神經節中的前支、中支和后支神經分支清晰可見。10 μM DAPT處理開始導致每個體節神經節中軸突生長缺陷和連接神經元缺失，以及發育中吻部的神經纖維分布異常。25 μM濃度處理則導致腹神經索形成和軸突生長嚴重紊亂。
免疫熒光染色進一步證實，DAPT處理導致推測的神經纖維網和連合中微管蛋白乙酰化（ac-tubulin）的表達退化，熒光強度顯著降低。定量分析顯示，熒光強度從對照組的7.5 ± 0.4降至DAPT處理組的2.66 ± 0.39。同時，定量PCR結果顯示，DAPT處理后，Hau-hes和Hau-hey的mRNA表達水平下降了超過60%，表明Notch信號被有效抑制。
討論
本研究在Glossiphoniid水蛭H. austinensis中鑒定并表征了Notch信號通路的核心成分。系統發育分析支持了這些成分在冠輪動物乃至后生動物中的保守性。表達譜分析揭示了Notch成分從胚胎第8期（生發板形成期）到第11期（器官發生期）的動態變化。在第8期，它們沿生發板及前部體節前體細胞的表達提示Notch信號可能參與體節發生和前后軸的形成。在第9至11期，這些成分在吸盤、吻部、背中線和腹神經節等神經相關結構中的表達，強有力地支持了Notch信號在水蛭神經發育中的重要作用。
功能實驗進一步證實了這一觀點。通過DAPT抑制Notch信號，導致腹神經索形成缺陷、軸突生長受損以及下游靶基因Hau-hes和Hau-hey表達下調，這與在渦蟲等其他動物模型中的觀察結果一致。這表明Notch信號的精確調控對于水蛭胚胎發生過程中正常的神經發生和體節形成至關重要。
總之，本研究通過整合基因組學、表達譜分析和功能實驗，揭示了Notch信號通路在H. austinensis體節發生和神經發育中的關鍵作用。這些發現不僅加深了對冠輪動物發育機制的理解，也為探索雙側對稱動物神經發生和體節化的進化保守機制提供了重要見解。
