甲狀腺疾病是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，其發(fā)病率逐年上升，構(gòu)成重大公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。其中，Graves病是碘充足地區(qū)甲狀腺功能亢進的主要原因，占病例的70%–80%。Graves病是一種累及包括甲狀腺在內(nèi)的多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病，常伴有復(fù)發(fā)、加劇以及甲狀腺癌、眼病等并發(fā)癥。甲狀腺癌是全球最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，盡管其總體死亡率相對較低，但一旦腫瘤進展或轉(zhuǎn)移，生存率會急劇下降。目前，病理學(xué)評估仍是THCA診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而超聲和細(xì)針穿刺活檢存在誤診風(fēng)險，手術(shù)切除雖然能夠確診，但具有侵入性和組織損傷的可能性。因此，迫切需要開發(fā)用于THCA早期診斷和預(yù)防的新方法。

自身免疫性疾病被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化的易感因素，會增加罹患腫瘤性疾病的風(fēng)險。臨床研究報告顯示，GD患者中甲狀腺癌的發(fā)病率高于一般人群，表明對THCA的易感性增加。近年來，生物標(biāo)志物在改善惡性腫瘤診斷方面顯示出相當(dāng)大的潛力。然而，盡管GD被認(rèn)為是早期THCA的風(fēng)險因素，目前尚未建立能夠共同診斷GD相關(guān)THCA的生物標(biāo)志物。因此，識別用于甲狀腺癌早期檢測的GD相關(guān)生物標(biāo)志物仍然是當(dāng)務(wù)之急。

本研究整合了多種生物信息學(xué)方法并進行實驗驗證。從30名甲狀腺癌患者中收集腫瘤及癌旁正常組織，并從健康對照、GD患者以及GD合并THCA患者中獲取血清樣本。研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫獲取THCA和GD相關(guān)數(shù)據(jù)，使用了GSE29265、GSE5364和GSE71956等多個數(shù)據(jù)集。

研究采用了加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析來構(gòu)建無標(biāo)度共表達網(wǎng)絡(luò)并識別疾病特異性基因模塊。通過差異表達分析，從GSE29265和GSE71956數(shù)據(jù)集中分別獲得了2170個和1238個差異表達基因。隨后，對共享基因進行了基因本體論和京都基因與基因組百科全書通路富集分析，強調(diào)了免疫相關(guān)通路。采用LASSO回歸算法，從21個共享基因中篩選出五個核心候選基因來構(gòu)建診斷模型，并使用隨機森林算法進一步精煉生物標(biāo)志物的選擇。利用CIBERSORT算法評估THCA中的免疫細(xì)胞浸潤。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用TIDE算法預(yù)測免疫治療反應(yīng)。此外，還通過Connectivity Map和GSCA數(shù)據(jù)庫進行小分子化合物篩選，并利用TargetScan、miRTarBase、DIANA Tools、LncBook和RNAInter等工具構(gòu)建了以TREM1為中心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究還進行了定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8、異種移植腫瘤模型、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀測定和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)等一系列體外和體內(nèi)實驗驗證關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)。

為了識別與THCA和GD均相關(guān)的關(guān)鍵基因，研究首先分析了差異表達基因，并分別在兩種疾病相關(guān)數(shù)據(jù)集中進行了WGCNA。通過設(shè)置軟閾值，實現(xiàn)了無標(biāo)度拓?fù)洌�并通過平均連鎖層次聚類識別出模塊。模塊-性狀相關(guān)性熱圖表明，藍色和黃色模塊與THCA和GD的關(guān)聯(lián)性最強，為后續(xù)研究提供了有前景的焦點。

為了探索THCA和GD的發(fā)病機制，研究交叉了來自WGCNA模塊的差異表達基因，識別出21個共享基因。隨后的GO和KEGG富集分析揭示了幾個顯著的免疫相關(guān)通路，包括吞噬作用、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。為了進一步精煉候選診斷基因，對這21個共享基因應(yīng)用了LASSO回歸算法，得出了五個潛在的標(biāo)志物——TREM1、S100A11、MRPS16、MET和ACTN1，它們可能在診斷GD相關(guān)的THCA中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

研究基于五個候選基因構(gòu)建了診斷模型，其風(fēng)險評分計算公式為：風(fēng)險評分 = 0.364 × TREM1表達 + 0.256 × S100A11表達 + 1.594 × MRPS16表達 + 0.749 × MET表達 + 0.427 × ACTN1表達。受試者工作特征曲線分析顯示，所有五個基因的曲線下面積值均>0.8，而模型的AUC達到了0.948，顯示出優(yōu)異的敏感性和特異性。精確率-召回率曲線分析進一步證實該模型優(yōu)于任何單個基因。研究還生成了列線圖來可視化預(yù)測能力，校準(zhǔn)曲線表明預(yù)測結(jié)果與觀察結(jié)果之間具有很強的一致性。此外，決策曲線分析支持了該模型在THCA診斷中的臨床實用性。最后，在兩個獨立數(shù)據(jù)集中的ROC曲線驗證證實了模型的可靠性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，功能富集分析表明21個共享基因與免疫過程密切相關(guān)。為了進一步表征THCA的免疫景觀，研究首先比較了GSE29265數(shù)據(jù)集中22種免疫細(xì)胞類型的分布，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和漿細(xì)胞的比例較高。計算THCA與正常組織中這些免疫細(xì)胞的富集評分，顯示THCA中M0巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平升高。此外，浸潤免疫細(xì)胞的圖譜分析表明，免疫群體與五個核心基因之間存在多重相關(guān)性。熱圖分析一致地證實，這五個基因的表達與免疫細(xì)胞，特別是M0巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)。這些結(jié)果共同表明，五個GD相關(guān)的THCA基因與免疫浸潤密切相關(guān)。

研究假設(shè)高風(fēng)險和低風(fēng)險組會表現(xiàn)出不同的免疫特征，因為炎癥和免疫細(xì)胞是GD相關(guān)THCA進展的關(guān)鍵驅(qū)動因素，因此評估了模型的免疫景觀。初步分析顯示，風(fēng)險評分與免疫評分和ESTIMATE評分呈正相關(guān)，而與基質(zhì)評分無顯著關(guān)聯(lián)。隨后，檢查了風(fēng)險評分與THCA中22種免疫細(xì)胞類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)十種免疫群體受風(fēng)險評分影響，最顯著的是活化的樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。此外，組間比較顯示，與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組中M0巨噬細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著富集。這些發(fā)現(xiàn)共同證明了模型衍生的風(fēng)險評分與免疫活性之間存在強烈關(guān)聯(lián)，為了解GD相關(guān)THCA的免疫調(diào)節(jié)機制提供了見解。

為了進一步識別GD相關(guān)THCA的中心基因，研究整合了多種分析方法。首先，將隨機森林算法應(yīng)用于21個共享基因，篩選出十個候選基因：SCO2、TREM1、ANPEP、ERGIC1、COL8A2、MRPS16、LYN、MET、ACTN1和LCN2。隨后，GSE29265數(shù)據(jù)集的PPI分析揭示了五個連接度最高的樞紐基因：TREM1、LYN、TYROBP、FGGR3B和ICAM1，突出了它們參與THCA進展的潛力。整合LASSO選擇的五個基因、隨機森林衍生的候選基因和PPI樞紐基因的結(jié)果，確定TREM1為最有希望的中心基因。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析進一步驗證了這一結(jié)果，顯示與正常對照組相比，TREM1在THCA和GD中的表達均升高，并且在合并GD和THCA的患者中上調(diào)最為顯著。

與生物信息學(xué)預(yù)測和觀察到的TREM1上調(diào)一致，其他四個核心基因的表達水平在GD患者以及GD合并THCA患者的PBMCs中也顯著升高。這種集體上調(diào)進一步支持了這五個基因參與GD和THCA共享的免疫失調(diào)。

為了進一步評估TREM1在腫瘤進展中的功能作用，在裸鼠中進行了皮下致瘤實驗。注射了shTREM1或陰性對照載體的細(xì)胞被注射到小鼠的側(cè)腹，并定期監(jiān)測腫瘤生長。與對照組相比，shTREM1組的腫瘤重量和體積顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)共同確立了TREM1作為GD和THCA的中心基因。

免疫治療已成為癌癥研究的主要焦點。本研究全面評估了TREM1的免疫治療相關(guān)性。首先，評估了TREM1表達與九個免疫檢查點基因之間的相關(guān)性，弦圖和熱圖均顯示存在強關(guān)聯(lián)。此外，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明TREM1與關(guān)鍵檢查點分子CD86和CTLA4直接相互作用，提示其可能在更廣泛的免疫檢查點網(wǎng)絡(luò)中作為上游調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。然后，功能評估顯示，低TREM1表達的樣本表現(xiàn)出較低的TIDE評分，這意味著當(dāng)TREM1在THCA中高表達時，免疫檢查點阻斷可能效果較差。此外，功能障礙分析表明，高TREM1表達與腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞失活增加相關(guān)，而低TREM1表達則與較高的MSI和Merck18評分相關(guān)，表明免疫治療反應(yīng)更有利。一致地，TREM1高表達組的免疫應(yīng)答率顯著降低。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明TREM1可能作為THCA患者免疫治療反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物，較低的表達水平預(yù)示著更大的治療效果。

為了識別靶向GD相關(guān)THCA患者中TREM1的小分子化合物，采用了一系列篩選策略。首先，將GSE29265數(shù)據(jù)集中與TREM1正負(fù)相關(guān)的前150個基因上傳到cMAP數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了6416種潛在化合物。同時，查詢CTRP數(shù)據(jù)庫，獲得了20種與TREM1表達相關(guān)的化合物。兩個數(shù)據(jù)集的交集確定了七種THCA候選化合物，包括異甘草素、替尼泊苷、Merck60、卡奈替尼、維A酸、MST-312和VER-155008。cMAP在10個細(xì)胞系中預(yù)測的熱圖顯示，VER-155008表現(xiàn)出最高的絕對負(fù)富集分?jǐn)?shù)，表明其具有逆轉(zhuǎn)TREM1過表達的潛力。CTRP數(shù)據(jù)庫分析一致地證實，具有高TREM1表達的THCA患者對VER-155008特別敏感。在GSE71956數(shù)據(jù)集中的驗證進一步支持了這一結(jié)果，顯示VER-155008保持了最強的負(fù)富集分?jǐn)?shù)。總之，VER-155008作為一種有前景的靶向TREM1的小分子化合物出現(xiàn)，對THCA和GD都具有潛在的治療意義。為了實驗評估其效果，進行了多項檢測。CCK8檢測表明VER-155008顯著抑制癌細(xì)胞活力。隨后，蛋白質(zhì)印跡分析顯示VER-155008抑制了TREM1蛋白表達。最后，IC₅₀測定表明，敲低TREM1增加了細(xì)胞對VER-155008的敏感性。

先前的研究表明ceRNA網(wǎng)絡(luò)在甲狀腺癌中起著關(guān)鍵作用。因此，我們在THCA中構(gòu)建并分析了與TREM1相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過整合TargetScan、DIANA TOOLS和miRTarBase數(shù)據(jù)庫，識別出21個可能靶向TREM1的miRNA。基于mRNA和miRNA之間負(fù)調(diào)控的原則，相關(guān)性分析將候選miRNA精煉為hsa-miR-421、hsa-miR-676-5p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-3652。鑒于其最強的負(fù)相關(guān)性，選擇hsa-miR-204-3p進行進一步研究。TargetScan預(yù)測證實了TREM1 mRNA和hsa-miR-204-3p之間的結(jié)合位點，并引入了定點突變。RIP檢測驗證了TREM1和hsa-miR-204-3p之間的直接相互作用。一致地，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，hsa-miR-204-3p模擬物顯著降低了野生型TREM1載體的熒光素酶活性，而對突變體載體沒有影響。此外，hsa-miR-204-3p模擬物抑制了B-CPAP細(xì)胞中TREM1的表達，而抑制劑增強了其表達。

隨后，利用LncBook和RNAinter數(shù)據(jù)庫篩選可能靶向hsa-miR-204-3p的lncRNA。在五個候選lncRNA中，只有HOTTIP與hsa-miR-204-3p表達呈負(fù)相關(guān)。hsa-miR-204-3p與HOTTIP的預(yù)測結(jié)合位點通過突變進一步驗證。雙熒光素酶測定證實，hsa-miR-204-3p降低了野生型HOTTIP載體的熒光素酶活性，但對突變體沒有影響。此外，HOTTIP的過表達對hsa-miR-204-3p的表達具有抑制作用。拯救實驗進一步證明，HOTTIP過表達可以抵消由hsa-miR-204-3p水平升高引起的對TREM1的抑制。

這些結(jié)果共同在THCA中建立了一個潛在的涉及HOTTIP/hsa-miR-204-3p/TREM1的ceRNA調(diào)控軸，為TREM1表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了新的見解。

作為一種自身免疫性疾病，Graves病被認(rèn)為是甲狀腺功能亢進的主要潛在因素。長期以來，GD一直被認(rèn)為會增加甲狀腺癌的風(fēng)險和侵襲性。在此背景下，據(jù)我們所知，我們的研究首次整合了兩種疾病的生物信息學(xué)分析和機器學(xué)習(xí)算法，從而識別出21個共享基因，并精煉出五個核心候選基因——TREM1、S100A11、ACTN1、MET和MRPS16。值得注意的是，本研究在上述五個核心基因的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個更全面的診斷模型，其結(jié)果顯示對THCA的診斷準(zhǔn)確性顯著優(yōu)于單個生物標(biāo)志物。這五個基因特征的診斷潛力得到了我們在GD和GD+THCA患者臨床樣本中實驗證實其協(xié)同上調(diào)的支持，將計算發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化證據(jù)聯(lián)系起來。

免疫系統(tǒng)的功能完整性與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，甲狀腺作為與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)的關(guān)鍵內(nèi)分泌器官。與此一致，并得到21個共享基因的GO/KEGG結(jié)果的支持，應(yīng)用CIBERSORT分析評估免疫細(xì)胞浸潤，揭示GSE29265中M2巨噬細(xì)胞比例最高，其次是M0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞等。THCA和正常組織在特定免疫亞群的浸潤方面也存在顯著差異，特別是M0巨噬細(xì)胞。作為腫瘤微環(huán)境中的主要免疫成分，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞已知能促進THCA的侵襲和轉(zhuǎn)移。在刺激下，M0巨噬細(xì)胞可根據(jù)其激活狀態(tài)、功能和分泌因子極化為M1或M2表型，從而通過細(xì)胞因子釋放驅(qū)動腫瘤進展。這一觀察結(jié)果與我們發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞在THCA樣本中占主導(dǎo)地位一致。此外，鑒于所有已識別的五個核心基因先前都與免疫相關(guān)，我們檢查了它們與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)與多個免疫亞群存在強關(guān)聯(lián)。值得注意的是，由我們的模型定義的高風(fēng)險和低風(fēng)險組在巨噬細(xì)胞浸潤，特別是M0巨噬細(xì)胞方面顯示出顯著差異，表明這些生物標(biāo)志物不僅可能有助于區(qū)分THCA，還可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞動態(tài)來影響癌癥進展。

機器學(xué)習(xí)最近已成為生物信息學(xué)中的強大工具，為揭示疾病相關(guān)機制提供了巨大潛力。在我們的研究中，應(yīng)用了機器學(xué)習(xí)方法，特別是隨機森林算法，并確定TREM1為中心基因。TREM1是免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面受體，通過誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)放大炎癥反應(yīng)。先前的研究強調(diào)TREM1既是THCA的生物標(biāo)志物也是治療靶點，其過表達通過增強調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤促進了免疫抑制微環(huán)境。然而，其在GD中的作用尚不清楚。我們的結(jié)果表明，TREM1在Graves病患者中表達顯著升高，并且在合并GD和THCA的患者中進一步升高，表明TREM1在自身免疫背景下的腫瘤促進中可能發(fā)揮作用。小鼠模型中的功能驗證表明，敲低TREM1顯著抑制了腫瘤生長，支持了其促腫瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)暗示TREM1可能是自身免疫炎癥和甲狀腺癌發(fā)生之間的關(guān)鍵連接點。此外，在THCA中，高TREM1表達與免疫檢查點表達呈正相關(guān)，并可預(yù)測免疫治療的療效。

藥物治療仍然是甲亢和THCA管理的基石，這凸顯了對更有效治療劑的迫切需求。在本研究中，我們觀察到沉默TREM1表達有效降低了VER-155008的IC₅₀，緩解了THCA患者對VER-155008的耐藥性。VER-155008是一種有效的HSP70抑制劑，通過結(jié)合HSP70 ATPase結(jié)構(gòu)域并模擬其結(jié)合位點來發(fā)揮作用，從而抑制HSP70活性。先前的研究已證實其能夠抑制甲狀腺未分化癌細(xì)胞的類凋亡。

ceRNA假說引入了一個關(guān)鍵的調(diào)控模型，其中ceRNA通過競爭性結(jié)合miRNA來影響基因表達。積累的證據(jù)已證實ceRNA參與多種癌癥的發(fā)生和進展。基于這一概念，我們研究了THCA中以TREM1為中心的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。通過整合三個數(shù)據(jù)庫，hsa-miR-204-3p被確定為關(guān)鍵miRNA，隨后對另外兩個數(shù)據(jù)庫的分析強調(diào)了HOTTIP作為一個相關(guān)的lncRNA。值得注意的是，HOTTIP已被證明通過調(diào)節(jié)特定的miRNA來促進甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。在我們的研究中，HOTTIP/hsa-miR-204-3p/TREM1軸被實驗驗證為TREM1表達的調(diào)節(jié)因子。

盡管進行了嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析和實驗驗證，但本研究存在一些局限性。首先，甲狀腺功能減退癥相關(guān)研究的稀缺限制了我們的分析只能使用一個合格的數(shù)據(jù)集，并且樣本類型的異質(zhì)性可能引入偏差。其次，本研究中使用的GD和THCA相關(guān)GEO數(shù)據(jù)集在人口統(tǒng)計學(xué)特征上存在差異。第三，雖然我們使用體外和體內(nèi)模型提供了TREM1功能驗證，但缺乏自身免疫背景限制了研究結(jié)果的生理相關(guān)性。此外，雖然提出的HOTTIP/miR-204-3p/TREM1 ceRNA軸得到了體外實驗的支持，但整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面體內(nèi)驗證超出了本研究范圍。

總之，我們成功篩選并分離出五個與免疫密切相關(guān)的GD和THCA共享核心基因。通過利用這五個基因，我們構(gòu)建了一個THCA診斷模型。更重要的是，我們進一步挖掘了涉及的中心基因，并深入探討了TREM1所扮演的角色，增進了目前對GD和THCA發(fā)病機制的理解。