《Autophagy》：Increased macrophage autophagy with unique polarization in rheumatoid synovium
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本研究首次系統揭示類風濕性關節炎（RA）滑膜中巨噬細胞自噬活性顯著增強，并鑒定出一種共表達M1/M2樣標志（如CD86+MRC1+NOS2+CD163+）的獨特巨噬細胞亞群（M1/M2樣），其自噬相關分子表達水平最高。該發現將巨噬細胞表型極化與自噬通路緊密關聯，提示自噬可能在調節RA炎癥與組織修復平衡中發揮關鍵作用，為靶向自噬-巨噬軸治療RA提供了新視角。
Introduction
類風濕性關節炎（RA）是一種影響約1%人口的慢性炎癥性全身性疾病，主要特征為滑膜炎和關節破壞。巨噬細胞在RA的發病機制中起著至關重要的作用。自噬（autophagy）是維持細胞內穩態的關鍵過程，但其在巨噬細胞極化中的作用尚不清楚。本研究旨在探討RA滑膜中自噬相關分子的表達和巨噬細胞表型。
Results
Evaluation of synovitis by Krenn classification
使用Krenn組織學評分系統（0-9分）評估滑膜炎嚴重程度。RA（n=19）滑膜組織的評分（5.8±2.0）顯著高于骨關節炎（OA， n=21， 2.5±1.1）和低炎癥滑膜（LIS， 髖部骨折患者， n=4， 0.25±0.4），表明RA存在顯著的炎癥反應。
Observation of ultrastructural morphology by electron microscopy
透射電子顯微鏡觀察顯示，RA滑膜組織中巨噬細胞樣滑膜A細胞和內膜巨噬細胞內存在豐富的自噬相關結構，如早期自噬跡象（胞質內隔離）、含有細胞質物質和細胞器的雙膜囊泡（自噬體樣結構）以及大的吞噬泡樣囊泡。相比之下，OA滑膜組織主要由成纖維細胞樣滑膜B細胞組成，自噬結構較少見。
Immunohistochemical analysis
通過免疫組化分析自噬相關分子（ATG3， ATG5， LC3B， WIPI2， BECN1， ATG16L1， LAMP1， SQSTM1）在滑膜中的表達。結果顯示，與OA和LIS相比，RA滑膜（包括滑膜襯里層和襯里下層基質）中所有檢測的自噬相關分子表達均顯著更高。雙重免疫熒光染色顯示，這些自噬相關分子信號（紅色）在CD68+巨噬細胞（綠色）中頻繁共定位，而在CD248/TEM-1+成纖維細胞樣滑膜B細胞（綠色）和基質成纖維細胞中則較少。
免疫電子顯微鏡分析在RA組織的巨噬細胞樣滑膜A細胞和巨噬細胞的囊泡膜上觀察到自噬相關分子ATG5的陽性信號。
對CD68+巨噬細胞的定量分析顯示，RA滑膜襯里層和襯里下層基質中CD68+細胞的比例和熒光面積百分比均顯著高于OA和LIS。
通過雙重免疫熒光染色分析巨噬細胞表型。在RA增生的滑膜中，觀察到NOS2/iNOS+（M1樣）巨噬細胞、CD163+（M2樣）巨噬細胞，以及同時表達NOS2+和CD163+表型的巨噬細胞（M1/M2樣）。CD163+巨噬細胞主要分布在增生的滑膜襯里層及其附近，而NOS2+巨噬細胞則傾向于分布在更深的層次。與OA和LIS樣本相比，RA滑膜組織中這些雙陽性巨噬細胞在滑膜襯里層的存在顯著更高，在襯里下層基質中也呈現更多趨勢。
使用CD86（M1樣標志）和MRC1/CD206（M2樣標志）的雙重染色也證實了RA滑膜中存在CD86+MRC1+雙陽性巨噬細胞（M1/M2樣），且其在RA中的存在顯著高于OA。MERTK+（M2樣）巨噬細胞在RA滑膜中的分布與CD163+相似。
Western blot analysis
蛋白質印跡分析顯示，自噬相關蛋白ATG16L1、BECN1和LC3B的表達水平在RA中最高，OA次之，LIS最低，與滑膜炎嚴重程度呈正相關。
Flow cytometry of cells isolated from synovial tissue
對從RA（n=6）、OA（n=8）和LIS（n=4）滑膜組織中分離的細胞進行流式細胞術分析。使用抗ITGAM/CD11b（泛巨噬細胞標志）、抗CD86（M1樣）和抗MRC1（M2樣）抗體，將ITGAM+細胞分為M0樣（ITGAM+CD86?MRC1?）、M1樣（ITGAM+CD86+MRC1?）、M2樣（ITGAM+CD86?MRC1+）和雙陽性M1/M2樣（ITGAM+CD86+MRC1+）巨噬細胞。
在RA滑膜組織中，M1/M2樣巨噬細胞占最大比例（平均53.58%），而在OA組織中，M0樣巨噬細胞占主導（平均38.9%）。在LIS中，M2樣巨噬細胞比RA或OA更普遍。統計分析顯示，RA中M1/M2樣巨噬細胞的比例顯著高于OA，而OA中M0樣巨噬細胞的比例顯著高于RA。M1樣和M2樣巨噬細胞的比例在三組間無顯著差異。
進一步分析自噬相關標記物（LAMP1， WIPI2， BECN1， LC3B， SQSTM1）在不同巨噬細胞表型中的表達強度（中位熒光強度， MFI）。在RA和OA中，M1/M2樣巨噬細胞的各自噬標記物MFI均傾向于高于M1樣或M2樣巨噬細胞。特別是在RA中，LAMP1在M1/M2樣巨噬細胞中的MFI顯著高于M1樣和M2樣巨噬細胞。綜合來看，M1/M2樣巨噬細胞表現出最高的自噬相關分子表達水平。
Discussion
本研究發現，與成纖維細胞相比，自噬相關分子在RA滑膜的巨噬細胞中表達更為顯著。研究首次比較了RA和OA滑膜中巨噬細胞表型和自噬相關標記物的表達。
在RA滑膜中，MERTK+和/或CD163+M2樣巨噬細胞在增生的襯里層中豐富，而CD86+和NOS2+M1樣巨噬細胞則定位于更深的襯里下層。這些表型在空間上的接近表明，即使在活動性炎癥區域，也存在試圖緩解炎癥和組織修復的努力。
研究還通過免疫染色和流式細胞術在RA和OA滑膜中均鑒定出同時表達M1樣和M2樣表型的巨噬細胞（M1/M2樣）。這些特征性的雙陽性巨噬細胞在滑膜襯里層比在襯里下層基質中更普遍。流式細胞術鑒定出的M1/M2樣巨噬細胞（CD86+MRC1+）在RA中比在OA中更普遍。值得注意的是，M1/M2樣巨噬細胞在巨噬細胞亞群中顯示出最高的自噬相關分子表達。這種雜交表型表明巨噬細胞表型存在一個譜系，挑戰了傳統的M1和M2二元分類。
在LIS組織中，M2樣巨噬細胞相對豐富，而M1/M2樣巨噬細胞的比例介于RA和OA之間。這些發現支持M2樣巨噬細胞可能代表低炎癥狀態下的穩態或組織修復表型。OA中M0樣巨噬細胞占主導可能反映了相對靜止的巨噬細胞群體，而RA中M1/M2樣巨噬細胞的增加則表明了對持續炎癥反應的動態極化過程。
自噬與巨噬細胞極化在RA滑膜中密切相關。富含自噬標記物的M1/M2樣巨噬細胞可能在調節炎癥和組織修復中發揮抗炎作用。這些發現提示了一種RA巨噬細胞功能中潛在的自噬介導的調節機制。自噬相關通路可能代表調節RA巨噬細胞狀態的潛在治療靶點。
Materials and methods
本研究獲取了19例RA患者、21例OA患者和4例髖部骨折老年患者（作為LIS對照）的滑膜組織。所有程序均符合《赫爾辛基宣言》，并獲得機構倫理委員會批準及患者知情同意。
通過Krenn分類對滑膜組織進行組織學評分評估滑膜炎程度。使用透射電子顯微鏡觀察超微結構形態。通過免疫組織化學、蛋白質印跡和流式細胞術分析自噬相關分子和巨噬細胞表型。使用針對CD68、CD248、NOS2/iNOS、CD163、CD86、MRC1、MERTK等標志物的抗體進行染色和定量分析。從滑膜組織中分離細胞，使用抗ITGAM/CD11b、CD86、MRC1抗體進行流式細胞術分析，并檢測自噬相關分子（LAMP1， WIPI2， BECN1， SQSTM1， LC3B）的表達強度。統計數據以均值±標準差表示，使用Prism軟件進行統計分析。
