mRNA（信使核糖核酸）技術(shù)憑借其快速生產(chǎn)、設(shè)計靈活和成本效益高等優(yōu)勢，被視為新一代治療平臺。然而，目前大規(guī)模mRNA合成主要依賴于T7 RNA聚合酶催化的體外轉(zhuǎn)錄，該過程常產(chǎn)生不必要的雙鏈RNA副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物會引發(fā)先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白表達降低、細胞毒性炎癥甚至細胞死亡，嚴重影響mRNA藥物的安全性與有效性。隨著mRNA應(yīng)用從預(yù)防性疫苗擴展到治療性疫苗、蛋白替代療法和體內(nèi)CAR-T細胞療法等領(lǐng)域，所需mRNA劑量可能提升百倍乃至千倍，對雜質(zhì)（尤其是雙鏈RNA）的嚴格控制變得至關(guān)重要。盡管已有通過優(yōu)化反應(yīng)條件或理性設(shè)計改造T7 RNA聚合酶的策略，但它們往往在產(chǎn)量、活性或穩(wěn)定性方面存在局限。因此，開發(fā)一種兼具高催化效率、高穩(wěn)定性和低雙鏈RNA副產(chǎn)物的T7 RNA聚合酶變體，已成為推動高質(zhì)量治療性mRNA生產(chǎn)的迫切需求。

為解決這一難題，研究人員利用了一種超高通量的、基于適配體的熒光激活液滴分選平臺，對T7 RNA聚合酶進行了四輪定向進化。他們首先建立了將RNA合成與熒光信號偶聯(lián)的高通量篩選系統(tǒng)。接著，通過半理性設(shè)計，針對與雙鏈RNA形成可能相關(guān)的溶劑不可及腔區(qū)進行突變文庫構(gòu)建，并結(jié)合分子動力學模擬進行機制分析。

研究主要得出以下結(jié)論：

研究人員設(shè)計了一個包含T7啟動子序列和iSpinach RNA適配體的DNA模板。只有當全長轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生時，適配體才能結(jié)合染料DFHBI并發(fā)出熒光，從而實現(xiàn)了對T7 RNAP酶活性的超高通量、高靈敏度篩選，每天可篩選多達10⁸個變異體。

首輪進化在45°C下施加選擇壓力，篩選獲得了活性提升的變體S397W/S430P，其催化活性經(jīng)熱預(yù)處理后比野生型提高了5.6倍。

通過針對溶劑不可及腔區(qū)的半理性設(shè)計，進行了多輪進化篩選。最終獲得的M30變體（包含S43E/S397W/S430P/S633P/Q744R/Q786M突變）在熱預(yù)處理后活性比野生型提高58倍，雙鏈RNA副產(chǎn)物減少約9.8倍。

在37°C下，M30的比活性約為野生型的10倍；在50°C下，其比活性更是野生型的113倍。同時，M30的熱穩(wěn)定性顯著增強，熔解溫度比野生型高9°C。重要的是，M30合成的RNA其3‘端同質(zhì)性（60%）遠高于野生型（5.6%），且通過同位素標記實驗證實其3‘端延伸產(chǎn)物和雙鏈RNA副產(chǎn)物水平顯著降低。

生物層干涉實驗表明，M30對RNA的結(jié)合親和力比野生型弱約4.56倍。相反，電泳遷移率變動分析顯示M30對DNA模板的結(jié)合親和力增強。分子動力學模擬進一步揭示，M30能與DNA模板形成更多氫鍵，并具有更低的構(gòu)象自由能，這有利于穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并抑制RNA介導(dǎo)的異常延伸。

在多種DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄中，M30在37°C和50°C下的mRNA產(chǎn)量均顯著高于野生型和商用變體NEB-Hi-T7，且雙鏈RNA水平極低。在細胞和小鼠模型中，M30合成的mRNA能實現(xiàn)高效蛋白表達，同時引發(fā)的免疫反應(yīng)（如IL-6和IFN-α水平）顯著低于野生型產(chǎn)物，證實了其低免疫原性優(yōu)勢。

本研究的核心結(jié)論在于，通過超高通量定向進化獲得的T7 RNA聚合酶變體M30，成功地將高催化效率、增強的熱穩(wěn)定性與大幅降低的雙鏈RNA副產(chǎn)物生成相結(jié)合。其性能優(yōu)于現(xiàn)有的商用變體。機制上，M30通過改變對DNA和RNA模板的相對結(jié)合親和力，即增強DNA結(jié)合、削弱RNA結(jié)合，從而提高了“模板選擇性”，有效抑制了導(dǎo)致雙鏈RNA形成的異常轉(zhuǎn)錄事件。這項研究不僅為生產(chǎn)高質(zhì)量、低免疫原性的治療性mRNA提供了強大的新型催化劑，也為未來聚合酶的工程化改造引入了“模板選擇性”這一新的設(shè)計原則，對推動mRNA技術(shù)在腫瘤疫苗、蛋白替代療法等更廣闊治療領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。該論文已發(fā)表在《Research》期刊上。