為探究MmPKCα在RGNNV感染中的潛在作用，研究人員首先分析了其在受感染細胞中的表達動態(tài)。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析顯示，感染后宿主細胞中MmPKCα的mRNA水平顯著上調(diào)，并在感染后4小時（hpi）達到峰值。蛋白質(zhì)印跡法進一步證實，RGNNV感染不僅增加了MmPKCα的總蛋白水平，還特異性增強了其Thr496位點（一個關(guān)鍵的激活環(huán)殘基）的磷酸化，表明RGNNV誘導了MmPKCα的激活。

功能研究證實了MmPKCα活性對病毒入侵的影響。使用PKC激活劑佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）處理細胞或異位表達MmPKCα，均能顯著增加感染后2小時和4小時RGNNV衣殼蛋白（CP）mRNA的水平。相反，使用Go 6983藥物抑制PKC，或通過小干擾RNA（siRNA）敲低MmPKCα，則能顯著降低病毒CPmRNA的水平。為了確認MmPKCα激酶活性的重要性，研究人員構(gòu)建了MmPKCα的磷酸化缺陷突變體（T496A, T637A, S656A）。任何一個單點突變都削弱了MmPKCα增強CP表達的能力。這些結(jié)果共同證明，RGNNV激活了MmPKCα，而MmPKCα以激酶活性依賴的方式促進RGNNV的入侵。

在確定MmPKCα促進RGNNV入侵后，研究人員探索了這一促病毒功能的分子基礎(chǔ)。考慮到CP是病毒唯一的衣殼蛋白并介導病毒入侵，他們研究了MmPKCα與CP之間潛在的相互作用。引人注目的是，單獨過表達CP就足以提升MmPKCα的蛋白水平及其Thr496位點的磷酸化，表明RGNNV可能通過其CP激活MmPKCα。免疫熒光（IF）顯示，MmPKCα和CP蛋白在HEK293T細胞的細胞質(zhì)中共定位。免疫共沉淀（Co-IP）證實了MmPKCα和CP蛋白之間存在雙向結(jié)合。此外，研究發(fā)現(xiàn)它們的相互作用不依賴于MmPKCα的磷酸化狀態(tài)，因為磷酸化缺陷的三重突變體（T496A/T637A/S656A）仍然能與CP結(jié)合。

為了確定相互作用的界面，研究人員構(gòu)建了MmPKCα和CP的一系列截短突變體。Co-IP實驗表明，MmPKCα的C端（CT）結(jié)構(gòu)域是與CP結(jié)合所必需的，其缺失（ΔCT）完全消除了相互作用，而其他結(jié)構(gòu)域的缺失則沒有影響。相比之下，CP中任何單一結(jié)構(gòu)域的缺失都不會破壞其與MmPKCα的結(jié)合，這表明CP通過多位點或構(gòu)象界面與MmPKCα結(jié)合。

MmPKCα與CP之間強有力的相互作用促使研究人員探究MmPKCα本身是否作為RGNNV的細胞表面受體。對非透化細胞的免疫熒光分析證實，一部分MmPKCα定位于質(zhì)膜，并且這種表面相關(guān)的部分在RGNNV感染或CP過表達后有所增加。然而，功能實驗論證了MmPKCα并非受體。首先，過表達或敲低MmPKCα均不影響RGNNV病毒顆粒在4°C下與宿主細胞的結(jié)合。其次，與已知的受體MmMYL3不同，過表達MmPKCα未能使原本不易感的HEK293T細胞變得允許RGNNV入侵。同樣，加入MmPKCα并未顯著影響MmMYL3的增強效應。第三，將病毒與重組MmPKCα蛋白預孵育，或用抗PKCα抗體預處理細胞，均未能阻斷病毒入侵。這些結(jié)果證實MmPKCα是作為一種信號輔助因子而非病毒受體發(fā)揮作用，其通過附著后機制發(fā)揮促病毒效應。

既然MmPKCα不是受體但能促進RGNNV入侵，研究人員假設(shè)其作用于已知的RGNNV受體MYL3下游，該受體通過巨胞飲作用介導RGNNV入侵。使用Alexa Fluor 647標記的葡聚糖作為巨胞飲示蹤劑，研究發(fā)現(xiàn)RGNNV感染強烈刺激了宿主細胞中的巨胞飲作用。在MmMYL3過表達的細胞中，RGNNV誘導的葡聚糖攝取可被Go 6983處理或MmPKCα敲低有效抑制，這表明MmPKCα是RGNNV觸發(fā)巨胞飲作用所必需的成分，并且MYL3的促入侵功能依賴于MmPKCα。研究人員隨后探究了MmPKCα與MmMYL3的關(guān)系。MmMYL3過表達增加了MmPKCα的總蛋白水平和Thr496磷酸化，提示MmMYL3信號傳導激活了MmPKCα。免疫熒光和免疫共沉淀實驗證明了MmPKCα與MmMYL3之間存在相互作用，這通過GST pull-down實驗得到了進一步確認。這些數(shù)據(jù)將MmPKCα定位為MmMYL3受體的關(guān)鍵下游信號效應子，對于執(zhí)行RGNNV的巨胞飲入侵至關(guān)重要。

巨胞飲作用依賴于肌動蛋白細胞骨架的重排，而Cofilin是肌動蛋白動態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，研究人員探究了MmPKCα是否調(diào)節(jié)Cofilin的活性。首先，使用iFluor-488-phalloidin進行免疫熒光染色顯示，PMA處理能誘導宿主細胞發(fā)生強烈的肌動蛋白重排，而Go 6983處理則沒有效果，這提示了MmPKCα激活與肌動蛋白動態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。接下來，他們分析了MmPKCα與Cofilin之間的相互作用。MmPKCα在HEK293T細胞中與MmCFL1和MmCFL2均存在共定位。免疫共沉淀顯示，MmPKCα通過其催化結(jié)構(gòu)域（CD）和C端結(jié)構(gòu)域（CT）與MmCFL1/MmCFL2相互作用；缺失任一結(jié)構(gòu)域都會消除結(jié)合。此外，MmPKCα過表達以劑量依賴的方式促進了HEK293T細胞中MmCFL1和MmCFL2的表達。更重要的是，功能實驗表明，Go 6983增加了Cofilin Ser3位點的磷酸化（非活性形式），而PMA則促進了Cofilin的去磷酸化（活性形式），這表明MmPKCα抑制了Cofilin Ser3的磷酸化以維持其切割肌動蛋白的活性。最后，研究人員測試了MmPKCα結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)Cofilin中的作用。MmPKCα磷酸化位點的突變對Cofilin Ser3磷酸化沒有影響。然而，缺失MmPKCα的CT結(jié)構(gòu)域，而非CD結(jié)構(gòu)域，則使其抑制Cofilin磷酸化的能力喪失。這些結(jié)果表明，MmPKCα的CT結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合Cofilin并抑制其Ser3磷酸化至關(guān)重要，從而促進了巨胞飲作用所需的肌動蛋白重排。

病毒入侵是感染成功的關(guān)鍵決定因素。本研究闡明了RGNNV利用來入侵宿主細胞的新信號軸。研究數(shù)據(jù)支持一個模型：RGNNV通過其CP與MmMYL3受體結(jié)合，導致MmPKCα被募集和激活。激活的MmPKCα隨后直接與Cofilin相互作用并促進其去磷酸化，最終引發(fā)肌動蛋白驅(qū)動的膜皺褶和巨胞飲作用，從而將RGNNV推入宿主細胞。這一級聯(lián)反應闡明了RGNNV入侵的分子機制，并凸顯了PKCα作為硬骨魚類中細胞表面受體MmMYL3與細胞內(nèi)肌動蛋白重塑機制之間關(guān)鍵連接點的作用。

PKCα是經(jīng)典的PKC成員，在多種哺乳動物病毒的入侵中已有記載，但其在硬骨魚類病毒中的功能此前仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，RGNNV主動上調(diào)并磷酸化MmPKCα，且其激酶活性對于高效的病毒入侵不可或缺。值得注意的是，MmPKCα通過其CT結(jié)構(gòu)域直接與RGNNV CP相互作用；該相互作用不依賴于PKCα的磷酸化狀態(tài)。這種病毒-宿主蛋白相互作用可能有助于MmPKCα的激活，因為僅CP過表達就足以誘導MmPKCα磷酸化。然而，盡管MmPKCα定位于細胞表面并與MmMYL3相互作用，全面的受體驗證實驗（包括未改變的病毒結(jié)合、無法使非易感細胞變得允許、以及抗體或重組蛋白無法中和）最終證明MmPKCα是信號輔助因子而非結(jié)合受體，這解釋了其在不影響初始病毒附著的情況下促進入侵的能力。

巨胞飲作用是一種獨特的胞吞途徑，與病毒誘導的顯著的細胞范圍質(zhì)膜皺褶有關(guān)，這個過程依賴于多種激酶的協(xié)同作用。先前的研究表明，PKC抑制劑可以減少由病毒感染引起的巨胞飲作用。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示，無論是藥物抑制PKC還是敲低MmPKCα，都能有效減弱RGNNV誘導的巨胞飲作用。研究人員先前已確定MmMYL3是RGNNV的受體，其專門通過巨胞飲作用介導入侵，但將MmMYL3與巨胞飲執(zhí)行機制連接起來的信號事件尚不清楚。本研究顯示，MmMYL3直接與MmPKCα相互作用并通過Thr496磷酸化激活它，并且MmMYL3增強RGNNV入侵的能力依賴于PKC活性。這些發(fā)現(xiàn)確立了MmPKCα作為MYL3的關(guān)鍵下游效應子，將受體結(jié)合與巨胞飲作用的執(zhí)行連接起來。PKC抑制劑顯著阻斷MmMYL3增強感染的能力這一事實強調(diào)了該受體的促病毒功能是通過PKCα信號傳導實現(xiàn)的。

肌動蛋白細胞骨架重排是巨胞飲作用的機械驅(qū)動者，而Cofilin是這一過程的主調(diào)節(jié)因子。Cofilin的肌動蛋白結(jié)合活性通過其保守的Ser3位點的磷酸化（失活）和去磷酸化（激活）來控制，而PKCs已被認為是影響這一過程的有效調(diào)節(jié)因子。此外，PKCδ-Cofilin信號通路在病毒誘導的巨胞飲作用中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。為了探究MmPKCα是否與Cofilin具有相似的功能，研究人員首先確認了MmPKCα與MmCFL1和MmCFL2的相互作用。PKCα含有一個維持酶處于非活性構(gòu)象的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其催化結(jié)構(gòu)域能夠磷酸化適當?shù)牡孜镆赃M行進一步的下游處理。本研究結(jié)果顯示，屬于MmPKCα催化結(jié)構(gòu)域的CD和CT結(jié)構(gòu)域的缺失會消除其與MmCFL1和MmCFL2相互作用的能力，表明CD和CT結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛mPKCα與Cofilin的相互作用至關(guān)重要。除了MmPKCα與Cofilin的相互作用外，研究結(jié)果還顯示，MmPKCα增強了外源性和內(nèi)源性MmCFL1和MmCFL2的表達，同時抑制了Cofilin的磷酸化，從而促進了Cofilin的肌動蛋白切割活性。值得注意的是，研究結(jié)果顯示，MmPKCα中T497、T637和S656的突變并未顯著誘導Cofilin Ser3的去磷酸化。然而，CT結(jié)構(gòu)域的缺失則顯著抑制了Cofilin的去磷酸化。考慮到T637和S656都位于CT結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這些結(jié)果表明MmPKCα介導的Cofilin活性調(diào)節(jié)可能依賴于CT結(jié)構(gòu)域本身或T637和S656的協(xié)同磷酸化。在哺乳動物系統(tǒng)中，Cofilin Ser3的磷酸化受到激酶（如LIMK、TESK）和磷酸酶（如SSH）平衡的嚴格控制。將這種保守的調(diào)控框架擴展到硬骨魚類，研究人員提出了MmPKCα CT結(jié)構(gòu)域功能的兩種非互斥模型：其一，CT結(jié)構(gòu)域可能直接與SSH或其上游調(diào)節(jié)因子相互作用，促進SSH募集至Cofilin并增強其去磷酸化；其二，CT結(jié)構(gòu)域可能立體阻礙LIMK或TESK接近Cofilin，從而減少Ser3磷酸化。未來的研究將通過探究MmPKCα CT結(jié)構(gòu)域與Cofilin磷酸化/去磷酸化機制關(guān)鍵組分在海洋青鰨中的相互作用來驗證這些假說。

值得注意的是，目前的PKC抑制劑缺乏亞型特異性，限制了其體內(nèi)應用和治療潛力。本研究確定了MmPKCα的CT結(jié)構(gòu)域是一個雙功能模塊：它介導與RGNNV CP的相互作用并調(diào)節(jié)Cofilin的磷酸化。這種雙重作用使得CT結(jié)構(gòu)域成為開發(fā)亞型特異性抑制劑的一個有前景的靶點。與廣譜PKC抑制劑不同，靶向CT結(jié)構(gòu)域的制劑將選擇性地破壞MmPKCα依賴的RGNNV入侵，而不干擾其他PKC亞型或宿主的內(nèi)吞穩(wěn)態(tài)。

總而言之，本研究揭示了MmPKCα通過全新的“MmMYL3-MmPKCα-Cofilin”信號軸促進RGNNV入侵。作為RGNNV受體MmMYL3的關(guān)鍵下游效應子，MmPKCα通過結(jié)合Cofilin（MmCFL1/2）并抑制其Ser3磷酸化來驅(qū)動肌動蛋白重排，從而促進MmMYL3介導的巨胞飲作用。這些發(fā)現(xiàn)確立了MmPKCα在RGNNV感染中的關(guān)鍵信號樞紐地位，并為其作為抗病毒神經(jīng)壞死癥（VNN）策略的潛在治療靶點提供了依據(jù)。