EsxN（Rv1793）是結核分枝桿菌 Esx-5 分泌系統的底物之一，其氨基酸序列在分枝桿菌物種間高度保守，暗示了其功能的重要性。為研究其生物學功能，研究者在非致病性的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）中利用乙酰胺誘導過表達了結核分枝桿菌來源的 EsxN。實驗發(fā)現，過表達 EsxN 改變了恥垢分枝桿菌的菌落形態(tài)，使其表面皺褶減少、邊緣更光滑；在含 20% 葡萄糖的 7H9 培養(yǎng)基中進行生物被膜培養(yǎng)時，EsxN 改變了生物被膜結構，促進了皺褶的形成；此外，Ms_EsxN 菌株在含梯度瓊脂糖的 7H9 平板上表現出明顯減弱的滑動運動能力。這些結果表明 EsxN 重塑了恥垢分枝桿菌的細胞被膜，鑒于脂質在結核分枝桿菌毒力中的關鍵作用，推測 EsxN 可能作為調節(jié)分枝桿菌致病性的關鍵效應蛋白。

為了驗證 EsxN 是否真正參與影響宿主細胞免疫反應和分枝桿菌的免疫逃逸能力，研究者首先建立了用野生型 THP-1 細胞感染 Ms_pAL（對照）或 Ms_EsxN 的感染模型。結果發(fā)現，EsxN 顯著增強了分枝桿菌在宿主細胞內的存活。在小鼠骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）感染實驗中，也觀察到了同樣的現象。進一步研究發(fā)現，EsxN 的過表達并不影響巨噬細胞的吞噬能力或分枝桿菌的侵襲能力，胞內外的細菌載量相近，表明感染早期巨噬細胞對分枝桿菌的吞噬、消化和裂解能力未受影響。更重要的是，生長曲線分析證實 EsxN 過表達并不影響細菌本身的內在生長動力學。隨后，通過 CCK-8 法檢測感染后宿主細胞活力，在感染后 6 小時、24 小時和 48 小時均未檢測到 THP-1 細胞存活率的顯著差異。這些數據共同表明，EsxN 介導的免疫逃逸源于其對細菌持久性機制的直接增強，而非通過調節(jié)宿主細胞死亡途徑。

分枝桿菌在宿主細胞內的存活能力常與感染引發(fā)的炎癥免疫反應密切相關。研究發(fā)現，與 Ms_pAL 感染的 THP-1 細胞相比，Ms_EsxN 感染在 24 小時和 48 小時時間點顯著下調了先天免疫的經典炎癥細胞因子以及炎癥小體核心組分 NLRP3 的轉錄水平。在原代小鼠 BMDMs 中也觀察到了同樣的促炎細胞因子抑制現象。免疫印跡結果證實，Ms_EsxN 感染組的 IL-1β 表達水平確實低于 Ms_pAL 組。這表明 EsxN 削弱了宿主的促炎免疫反應，為分枝桿菌在宿主細胞內的存活提供了更穩(wěn)定的環(huán)境。

另一方面，對兩個結核病患者數據集的分析顯示，結核分枝桿菌感染顯著上調了 IFN-I 反應。研究者在 THP-1 細胞中敲低了 I 型干擾素通路的上游受體 IFNAR1 以阻斷該通路，發(fā)現感染恥垢分枝桿菌 24 小時后，細菌在敲低細胞中的存活率顯著降低，證明 I 型干擾素確實不利于宿主清除分枝桿菌。進一步的 RT-qPCR 檢測證實，EsxN 誘導了更高水平的 I 型干擾素反應相關基因的轉錄。對感染 48 小時的 THP-1 細胞進行轉錄組學分析發(fā)現，I 型干擾素相關基因的轉錄水平顯著上調，基因集富集分析（GSEA）也富集到了 I 型干擾素反應通路。Ms_EsxN 感染組中 ISG15 和 p-STAT1 蛋白表達水平的升高也佐證了 I 型干擾素信號的激活。這些數據表明，EsxN 通過上調宿主 I 型干擾素反應來拮抗細胞內的促炎免疫反應。為了進一步確認 EsxN 對促炎細胞因子的抑制作用是由 IFN-I 間接誘導還是 EsxN 直接驅動的事件，研究者在敲低 IFNAR1 后發(fā)現，IL1B 的表達在 Ms_EsxN 組中高于 Ms_pAL 組，表明 EsxN 并非驅動宿主促炎細胞因子減少的直接因素，I 型干擾素才是關鍵。

cGAS-STING 通路的發(fā)現是先天免疫領域的一個重要里程碑，它能感知外源性病原體來源的 dsDNA 和內源性胞質 dsDNA。轉錄組數據顯示，差異 GSEA 也富集了 IFN-β 反應通路。Ifnb 轉錄的上調是 cGAS-STING 信號通路激活的關鍵下游指標。因此，研究者推測 EsxN 可能通過影響 cGAS-STING 通路的激活，介導了觀察到的下游 I 型干擾素信號增強和細胞內存活增加。免疫印跡檢測 TBK1 和 p-TBK1 蛋白表達水平的結果顯示，EsxN 過表達促進了 TBK1 的磷酸化。此外，與 Ms_pAL 組相比，Ms_EsxN 組中 IRF3 蛋白的基礎表達水平更低，這表明 EsxN 激活了 cGAS-STING 通路。為進一步驗證，研究者使用了高靈敏度的 dsDNA 熒光染料 PicoGreen，并通過共聚焦顯微鏡證實，在感染 24 小時，EsxN 感染的 THP-1 細胞中胞質 dsDNA 水平升高。鑒于 TBK1 激活發(fā)生在感染早期，研究者在感染后 6 小時進一步量化了胞質 dsDNA 水平，同樣在 Ms_EsxN 感染的 THP-1 細胞中觀察到了更強的綠色熒光。這些結果表明，EsxN 可以在感染初始階段就誘導細胞產生更多 dsDNA，從而激活 cGAS-STING 信號通路，誘導下游干擾素刺激基因（ISGs）的轉錄。

然而，胞質 dsDNA 積累的確切來源和機制尚不清楚。考慮到溶酶體完整性對于維持細胞質穩(wěn)態(tài)至關重要，且溶酶體膜通透性增加可導致包括自身 DNA 在內的內容物泄漏到細胞質中，研究者推測 EsxN 可能通過損害溶酶體功能促進 dsDNA 釋放。對溶酶體膜蛋白 LAMP1 的初步檢測顯示，EsxN 過表達誘導了更高的 LAMP1 蛋白轉錄和表達。轉錄組分析也顯示溶酶體相關基因顯著上調，GSEA 富集了溶酶體通路，提示 EsxN 誘導的溶酶體應激（由 LAMP1 上調和溶酶體基因富集支持）促進了 dsDNA 泄漏到細胞質中。使用 LysoTracker 染色評估溶酶體狀態(tài)發(fā)現，EsxN 過表達組顯示出比對照組更強的 LysoTracker 熒光強度。為直接測試溶酶體改變是否導致胞質 dsDNA 增加，研究者使用巴弗洛霉素 A1（BafA1）抑制溶酶體酸化，隨后對胞質 dsDNA 的定量顯示，在 BafA1 處理下，EsxN 組的胞質 dsDNA 水平顯著降低。這些結果表明，EsxN 增強胞質雙鏈 DNA 數量的過程涉及溶酶體，強烈提示溶酶體是導致 EsxN 介導的感染過程中胞質 dsDNA 池增加的主要來源之一。

ISG15 是一種泛素樣修飾蛋白，通過 ISG 化修飾調節(jié) STING 和 cGAS 的活性，從而調節(jié) DNA 感知和抗病毒免疫。與轉錄組數據一致，ISG15 在 Ms_EsxN 感染的 THP-1 細胞中上調，這促進了 ISG15 可能在 EsxN 介導的宿主免疫反應中起關鍵作用的假說。免疫印跡分析顯示，EsxN 感染的細胞中 ISG15 和全局 ISG 化修飾顯著增強，并在感染后 48 小時達到最大誘導。隨后，研究者用 ISG15 缺陷的 THP-1 細胞進行感染，觀察到在感染 24 小時后，由 EsxN 過表達誘導的宿主 I 型干擾素反應差異消失了。共聚焦顯微鏡檢測胞質 dsDNA 水平顯示，在感染 6 小時的 ISG15 缺陷 THP-1 細胞中，兩者無顯著差異且趨于一致。這表明 ISG15 是 EsxN 誘導高水平 dsDNA 和隨后 cGAS-STING 激活所必需的。研究者進一步評估了兩種菌株在 ISG15 缺陷細胞中的胞內存活情況，發(fā)現 EsxN 賦予的存活優(yōu)勢被消除，證明 ISG15 缺陷抑制了由 EsxN 過表達介導的恥垢分枝桿菌存活增強。

巨噬細胞是結核分枝桿菌的天然宿主細胞。感染期間，結核分枝桿菌通過 T7SS 將底物毒力蛋白分泌到細胞膜或細胞外空間，進而與各種宿主蛋白相互作用，形成復雜的病原體-宿主互作網絡。因此，闡明結核分枝桿菌毒力蛋白參與宿主免疫反應的分子互作機制對于理解結核病發(fā)病機制至關重要。本研究證明 EsxN 誘導巨噬細胞釋放更多 dsDNA 到細胞質中。研究表明，溶酶體生物合成在胞質 dsDNA 的增加中起重要作用。研究者發(fā)現 EsxN 可能調節(jié)溶酶體生物合成，因為其過表達導致溶酶體數量和/或酸度增加。研究者認為這種溶酶體改變可能直接導致胞質 dsDNA 的釋放。

雖然本研究沒有深入探討核或線粒體 DNA 的潛在泄漏，但感染可能影響宿主細胞凋亡，導致凋亡小體的形成和裂解釋放 dsDNA。然而，對凋亡相關標志物的初步評估表明 EsxN 對凋亡影響甚微，Annexin V-FITC/PI 雙染也提示其可能不是宿主細胞死亡的機制。線粒體 DNA（mtDNA）是細胞內不同于核 DNA 的主要遺傳成分。線粒體損傷可導致 mtDNA 釋放到細胞質中。此外，使用 MitoTracker Green FM 染色，研究者觀察到感染 EsxN 過表達細菌導致線粒體質量或數量增加。這種線粒體擾動可能最終影響線粒體功能和 mtDNA 的穩(wěn)定性。當感知到這種胞質 dsDNA 時，cGAS 催化合成 cGAMP。這個第二信使然后結合并激活 STING，觸發(fā)下游信號級聯。激活的 cGAS-STING 信號通路誘導細胞核中 ISGs 的轉錄，同時拮抗促炎細胞因子的轉錄。這個級聯反應增強了分枝桿菌的胞內生存，這與 Esx-5 系統底物促進分枝桿菌從吞噬體中免疫逃逸的已知功能相符。重要的是，這個過程受到 ISG15 的調節(jié)和促進。然而，胞質 dsDNA 池的變化是否直接且主要由溶酶體功能貢獻仍有待證明。未來的研究應采用更精確的方法，如細胞器特異性 DNA 標記和追蹤、膜完整性評估和來源特異性核酸酶干預，以進一步解析 EsxN 介導的 dsDNA 釋放途徑及其在免疫逃逸中的具體作用。

目前對 EsxN 的研究主要集中在其作為結核病治療亞單位疫苗的潛力上。通過分析包含超過 5 萬個臨床結核分枝桿菌突變株的數據庫中 EsxN 的突變位點，研究者發(fā)現 EsxN 高度保守，臨床突變很少。EsxN 的高頻突變幾乎都是同義突變，表明 EsxN 更傾向于基因純化選擇，也證明了 EsxN 在基因組中相對穩(wěn)定和重要。本研究更深入地探討了 EsxN 在先天免疫中的功能特征，揭示了研究 EsxN-宿主相互作用對于解讀結核分枝桿菌毒力因子的作用模式和宿主細胞的感染結局至關重要。值得注意的是，EsxN 是與 Esx-5 系統的另一個底物 EsxM 以復合物形式分泌的。EsxM 先前已揭示了關于病原體進化和宿主-病原體相互作用的重要見解，這也表明兩者之間的功能相互作用是一個關鍵的研究領域，因為它們的共表達和潛在的協同效應可能對毒力至關重要。研究者目前正在探索 EsxM-EsxN 復合物的免疫調節(jié)作用，它們共表達的初步數據提示了協同效應，這將是未來研究的重點。

在病毒感染中，由 IFN-β 誘導、定位于細胞質的 MDA5 蛋白包含一個 CARD 結構域和一個 RNA 解旋酶基序。它結合病毒 dsRNA，感知病毒復制中間體。然而，I 型干擾素的誘導雖然在宿主防御病毒感染中很重要，但在細菌病原體（如結核分枝桿菌）的背景下是無效的，并且與更嚴重的疾病相關。研究表明，一個常見的 IFN-β 誘導基因程序與麻風病和結核病的疾病程度相關，表明 IFN-β 是這兩種不同分枝桿菌疾病中導致發(fā)病的共同因素。這與活動性結核病患者中觀察到的 I 型干擾素相關基因的表達趨勢一致。細菌和病毒采用不同的復制策略：細菌可以無性且獨立地復制，而病毒完全依賴宿主復制其遺傳物質。因此，上述蛋白（MDA5）無法有效靶向細菌遺傳物質。本研究關注細菌感染期間 I 型干擾素在塑造宿主感染過程和結局中的作用，更詳細地探討了 I 型干擾素在病毒和細菌感染中功能的異同。EsxN 觸發(fā)的 dsDNA 泄漏對 ISG15 的非經典依賴性為這種操控提供了一個特別有趣的層面。傳統上，ISG15 被認為是一種抗病毒的 ISG，可以通過蛋白質結合（ISG 化）或作為游離細胞因子發(fā)揮作用。研究者的數據表明，EsxN 利用了 ISG15 在調節(jié)細胞器膜穩(wěn)定性或 DNase 活性方面的一個先前未被認識的、不依賴于 STING 的作用。在本研究中，ISG15 不是一個被動的下游效應分子，而是一個關鍵的放大器，通過其修飾活性放大了初始的 dsDNA 信號，從而建立了一個驅動免疫抑制的正反饋循環(huán)。這是一個病原體將宿主防御武器轉化為自身生存工具的經典例子。研究者提出了一個模型，其中 EsxN 啟動了一個初始信號，然后被 ISG15 顯著放大，可能是通過對參與溶酶體生物合成、線粒體完整性或 DNA 修復的關鍵蛋白進行 ISG 化修飾。這種機制上的見解將 EsxN 置于越來越多的“通過激活進行劫持”的病原體效應蛋白之列，即將宿主最強大的防御系統轉而攻擊自身。

盡管一些研究表明 cGAS-STING 通路激活可能伴隨下游 NF-κB 的激活，但本研究結果顯示 NF-κB 活性沒有因 EsxN 過表達而產生顯著差異。研究者認為，EsxN 強烈上調 I 型干擾素反應，進而負向調節(jié)經典的促炎通路。這最終削弱了細胞的殺菌炎癥反應，并且 NF-κB 的激活被延遲，這進一步增強了分枝桿菌的生存，例證了免疫信號網絡內的平衡機制。

然而，本研究存在一定的局限性。研究者尚未能精確定義胞質 dsDNA 的細胞器來源，并且 EsxN 在其原生病原體結核分枝桿菌中的功能需要在 BSL-3 環(huán)境中進一步驗證。盡管如此，本研究提供了一個分子和細胞框架，說明一種分泌型結核分枝桿菌蛋白 EsxN 如何參與巨噬細胞免疫逃逸，解釋了 EsxN 如何作為結核分枝桿菌的毒力因子之一，在感染過程中調節(jié)細菌結構、免疫細胞反應及其靶點。在治療上，靶向 ISG15 或 dsDNA 泄漏可能破壞該通路，為結核病提供新的宿主導向療法。此外，EsxN 的保守作用支持了其作為亞單位疫苗候選物或診斷生物標志物的潛力。