在牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）ATCC 33277中刪除CRISPR陣列30.1并未顯著影響浮游細胞的生長，與野生型菌株相比，兩者生長曲線在50小時內形狀相似，均達到OD₆₀₀為1.3的平臺期。然而，對微孔板上生物膜形成的評估顯示，ΔCRISPR陣列30.1突變株的生物膜生物量顯著增加，通過藏紅染色和492 nm光密度測量（野生型平均OD₄₉₂值為0.165，突變株為0.185）進行量化。

為了直接評估CRISPR陣列30.1對細菌毒力的貢獻，通過注射不同細菌濃度（10⁷至10⁸CFU/mL）感染大蠟螟幼蟲。與野生型菌株相比，感染ΔCRISPR陣列30.1突變株的幼蟲死亡率顯著更高（P< 0.0001）。所有對照條件（生長培養基、熱滅活野生型和熱滅活突變株）在200小時觀察期內均顯示100%存活率。當細菌載量為6 × 10⁸CFU/mL時，突變株在130小時內誘導了50%的幼蟲死亡，而野生型菌株在200小時內的死亡率為38%。同樣，在較低接種量（6 × 10⁷和3 × 10⁸CFU/mL）下，與野生型菌株相比，感染突變株的幼蟲在200小時內的存活概率更高。對照幼蟲在7天觀察期內沒有死亡（存活概率為1）。

評估了CRISPR區域刪除對P. gingivalis細胞內代謝和宿主免疫反應的影響。使用經PMA處理的人單核細胞白血病細胞THP-1（一種巨噬細胞樣細胞系），通過Luminex多重檢測法測量感染后2小時和6小時細胞培養上清液中的細胞因子和趨化因子水平。巨噬細胞是牙周病病變中的關鍵炎癥細胞，參與口腔骨丟失。THP-1細胞產生了穩健、可重復的反應，能清晰區分實驗條件，并強烈轉變為經典的炎癥狀態。這反映了體內觀察到的現象：P. gingivalis招募并激活炎癥巨噬細胞，其效應物輸出（一氧化氮NO、促炎細胞因子和趨化因子）與感染負荷和骨吸收相關，從而驗證了巨噬細胞作為這些反應實驗的信息性宿主環境。

感染ΔCRISPR陣列30.1突變株導致IL-6、MIP-2α（CXCL2）、CXCL1和CXCL9的分泌顯著增加。IL-6在6小時時，野生型（約83 pg/mL）與ΔCRISPR突變株（約110 pg/mL）之間增加了約32%。CXCL9在兩個時間點比較中均顯示出最強的統計學顯著性，在6小時時變化倍數巨大（野生型：~0.05 pg/mL vs ΔCRISPR突變株：~1.8 pg/mL）。與2小時相比，顯著性主要出現在6小時，表明THP-1巨噬細胞中存在轉錄擴增，與穩健的NFκB/MAPK激活以及CXCR3配體趨化因子程序的啟動一致。到6小時，上游炎癥信號（經典的是NFκB和MAPK）導致IL6和CXCL1/2產生并進入細胞培養上清液。CXCL9的上升表明CXCR3配體趨化因子軸（受STAT1/IRF/NFκB控制的CXCL9/10/11基因）被明確激活，該軸可招募CXCR3+效應細胞，如Th1 T淋巴細胞和巨噬細胞。

CXCL1和CXCL2主要招募中性粒細胞，而CXCL9主要吸引T細胞、自然殺傷（NK）細胞和樹突狀細胞到炎癥部位。IL-10、IL-1α和IL-8（CXCL8）的水平也有所增加，但未達到統計學顯著性。CXCL1在6小時時顯示出最劇烈的增加（野生型約35 pg/mL vs ΔCRISPR突變株約240 pg/mL）。TNF-α顯示出非常高的濃度（兩種菌株均在~2,500–4,000 pg/mL范圍內），但野生型和ΔCRISPR突變株之間沒有明顯的顯著差異。

捕獲THP-1細胞和細胞內P. gingivalis基因表達變化的雙轉錄組分析揭示了廣泛且具有定量顯著性的通路改變，表明細菌和宿主細胞都發生了深刻的代謝重編程。基因參與的程度在不同通路間差異很大，由代表基因數量的點大小表示，一些通路包含大量基因集。

在每個時間點內，野生型和ΔCRISPR陣列30.1突變株的表達譜高度相似。相比之下，宿主細胞的轉錄譜受孵育持續時間的影響更大，2小時和6小時時間點之間的差異比由細菌菌株類型引起的差異更明顯。

感染后2小時，核糖體通路在細菌細胞中顯示出最高的倍數富集（約2.2–2.5倍），代表了最顯著激活的通路，伴侶蛋白和折疊催化劑以及線粒體生物發生通路的激活也很顯著。到6小時，核糖體功能仍然高度富集（約2.0倍），同時伴隨氨酰-tRNA生物合成（約1.8倍富集）、轉移RNA生物發生和轉錄機器的強烈激活，表明ΔCRISPR突變株中蛋白質合成機器的持續上調。ΔCRISPR突變株顯示出關鍵代謝和生物合成通路的增強激活，包括核心代謝（三羧酸循環TCA、糖酵解/糖異生、丙酮酸和丁酸代謝）以及2小時和6小時的核苷酸和氨基酸合成通路。值得注意的是，在感染后2小時，觀察到與分泌相關通路的獨特激活（蛋白質輸出、細菌分泌系統、群體感應和外膜囊泡形成）。

宿主細胞反應表現出更顯著的定量變化，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路在2小時顯示出最高的倍數富集（約5倍），其次是表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路（約4倍富集）。其他通路包括癌癥中的蛋白聚糖、肌醇磷酸代謝和磷脂酰肌醇信號系統，根據log₁₀(P)值均顯示出顯著的統計學激活。最引人注目的是，6小時的宿主反應顯示百日咳通路具有極高的倍數富集（約8.5倍），代表了在所有條件和時間點中觀察到的最劇烈的通路激活。碳水化合物代謝通路，包括果糖和甘露糖代謝以及核苷酸糖的生物合成，作為獨特且獨立的調控模塊出現，整體規模達到高達9倍的富集。

網絡分析揭示了通路富集未能捕捉到的額外復雜性層面。宿主通路網絡展示了免疫信號、代謝調控和細胞過程之間廣泛的相互聯系，通過顏色編碼清晰地劃分了時間特異性：紫色點代表2小時特異性通路，藍色點代表6小時特異性反應，黃色點代表常見通路，并疊加了上調（綠色）和下調（紅色）的基因表達模式。中樞通路作為具有多個連接的主要節點出現，尤其是在免疫信號簇內，表明跨生物過程的協調調控控制。宿主THP-1細胞在兩個時間點均顯示出核因子κB（NF-κB）信號和血小板激活的激活。在2小時，涉及免疫信號（B細胞受體信號、Fcγ受體介導的吞噬作用）、磷脂信號、細胞內鈣動員、生長因子信號（EGFR抑制劑耐藥、Ras信號）、脂肪酸調節（PPAR信號）和破骨細胞分化的宿主通路被高度激活。在6小時，碳水化合物代謝和免疫調節通路（氨基糖代謝、核苷酸糖合成和百日咳宿主-病原體相互作用）占主導地位。

細菌基因網絡呈現了更全面的圖景，數百個單個基因被映射到特定通路，揭示了這是大規模的代謝重編程，而非適度的通路調整。基因調控模式顯示通路簇內存在協調的上調（綠色）和下調（紅色），相關代謝通路（例如，核糖體簇、氨基酸代謝簇）聚集在一起。細菌網絡的密度和復雜性超過了宿主反應，表明CRISPR陣列刪除觸發了廣泛的細菌轉錄重組。與疾病相關的通路，包括與新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）和癌癥相關的通路，出現在宿主網絡中，但原始文本未加闡述，這暗示了病原體-宿主相互作用在疾病背景下的更廣泛意義。這種網絡層面的分析表明，ΔCRISPR突變株協調了跨多個生物過程的調控，代表了細菌生理學和宿主-病原體動力學的基本轉變，而非孤立的通路改變。

為了進一步闡明CRISPR間隔子調控細菌代謝的機制，我們使用CRISPR陣列30.1的119個單個間隔子作為引物，對ΔCRISPR陣列30.1突變株的基因組DNA進行了單引物擴增。我們對擴增產物進行了測序和定位，以揭示特定的基因組靶標。當我們使用野生型基因組DNA作為陽性對照時，我們主要擴增了CRISPR陣列30.1區域本身。正如預期，覆蓋度譜圖顯示了使用野生型DNA作為對照時的預期擴增模式。

SPA產生了兩種不同的擴增模式：真正的特異性結合和非特異性結合，后者以多樣化的PCR產物為特征。總體而言，119個間隔子中的41個（109個引物）產生了特異性的PCR產物，而68個間隔子產生了非特異性結合模式。SPA靶標分布在全基因組范圍，包括基因編碼區和基因間區。SPA結果顯示，靶標分布在整個環形染色體上，而非聚集分布。靶向的基因包括參與膜轉運（硫酸鹽通透酶、鎂轉運蛋白、轉運蛋白、含轉運蛋白底物結合域蛋白和ABC-F家族ATP結合盒域蛋白）、DNA復制、修復和修飾（切除核酸酶ABC亞基UvrA、位點特異性DNA甲基轉移酶、RecQ家族ATP依賴性DNA解旋酶和含UvrD-解旋酶域蛋白）、輔因子和維生素生物合成（鈷(I)啉酸a,c-二酰胺腺苷轉移酶[鈷胺素生物合成]、硫辛酸合酶、硒化物和水雙激酶SelD[硒代謝]）、接合和移動遺傳元件（接合轉座子蛋白TraK、接合轉移蛋白MobC和IS5家族轉座酶）、磷酸酶和水解酶（磷酸酶PAP2家族蛋白、堿性磷酸酶家族蛋白、MBL折疊金屬水解酶）、核心代謝和能量（延胡索酸還原酶/琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基、醛脫氫酶家族蛋白、NAD(P)依賴性氧化還原酶）、蛋白質合成和加工（甲硫氨酰-tRNA連接酶、延伸因子G、RsiV家族蛋白、S46家族肽酶、脯氨酰寡肽酶家族絲氨酸肽酶、信號肽酶I）、轉錄調控（螺旋-轉角-螺旋轉錄調節因子、反應調節轉錄因子）以及CRISPR-Cas系統（VI-B型CRISPR相關RNA引導的核糖核酸酶Cas13b）的基因。

此外，還在關鍵操縱子上游的基因間區發現了幾個靶標，更側重于移動遺傳元件（多個轉座酶）、蛋白質加工機制和轉運系統。多個插入序列（IS）元件的存在表明這些間隔子可能靶向與基因組不穩定性或水平基因轉移事件相關的區域。

富集分析揭示了間隔子靶向的特定定量模式，表明了對關鍵細胞過程的精確調控重點。最顯著富集的功能類別是硒化合物代謝過程，在百分比尺度上顯示出超過100個基因/項的富集水平，其次是鈷胺素生物合成過程和多個DNA相關過程的實質性富集，具有不同但顯著的富集水平。然而，在分析靶向功能的分布比例時，tRNA修飾成為主要類別，占所有間隔子靶標的29.41%，其次是翻譯延伸占14.71%。這表明近一半的CRISPR間隔子靶標集中在蛋白質合成機制上。其他功能類別顯示出更溫和但顯著的占比：蛋白水解、纈氨酰-tRNA氨酰化和DNA模板轉錄的調控各占靶標的8.82%，而硒化合物代謝過程、鈷胺素生物合成過程和鎂離子轉運各占總數的5.88%。最特異的調控靶標，DNA轉座和DNA復制調控，各占間隔子靶標的2.94%。這種定量分布揭示，CRISPR陣列30.1間隔子主要靶向翻譯機制（tRNA修飾和翻譯延伸合計占靶標超過44%），表明主要的調控機制涉及微調蛋白質合成能力和效率，而非廣泛的代謝控制，次要重點是蛋白水解過程和轉錄調控。

這項研究確定了牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277中不編碼的CRISPR陣列30.1先前未被認識的調控功能，確立了其作為細菌生理學和宿主-病原體相互作用的全局調節因子。刪除CRISPR陣列30.1導致了細菌轉錄組的實質性變化，包括增強的代謝和分泌通路、增加的生物膜形成、在大蠟螟感染模型中加速的毒力以及THP-1巨噬細胞中增強的促炎細胞因子反應。這些發現拓展了CRISPR-Cas系統在核酸靶向免疫之外的功能范圍，強調了其作為細菌毒力核心調節因子的潛力。

雖然自身靶向間隔子在多種細菌物種中都有記載，但其精確的調控作用在很大程度上仍是推測性的。我們的結果提供了間隔子介導的內源基因抑制的直接證據，正如通過SPA將CRISPR陣列30.1間隔子定位到自身基因組靶標所證明的那樣。這種調控模型與其他細菌中觀察到的機制一致，例如在土拉熱桿菌（Francisella novicida）中，Cas9介導的轉錄干擾利用小CRISPR相關RNA（scaRNA）來調節內源基因表達。在牙齦卟啉單胞菌中，間隔子-靶標相互作用顯著涉及對生物膜發展和細胞內生存至關重要的基因，如營養獲取、表面修飾和分泌相關的基因。

在ΔCRISPR 30.1突變株中觀察到的增強的生物膜形成支持了CRISPR陣列30.1負調控生物膜相關基因的觀點，可能促進細菌從生物膜生長向宿主細胞入侵的轉變。生物膜使牙齦卟啉單胞菌能夠在動態環境條件（包括口腔腔典型的波動氧氣和營養水平）下持續存在。我們的發現擴展了先前的報告，這些報告證明了I-B型CRISPR-Cas系統對牙齦卟啉單胞菌毒力所必需的新型粘附素的調控。

時間動態揭示了宿主-病原體相互作用中不同的調控階段，細菌反應在感染THP-1細胞后2小時和6小時均顯示出持續的代謝上調，而宿主反應則表現出時間依賴性通路轉換。在2小時，宿主細胞激活了生長因子信號（EGFR抑制劑耐藥）和脂質代謝（通過PPAR信號），表明對細菌入侵的初始代謝適應。已知牙齦卟啉單胞菌通過信號通路（包括PPAR激活）操縱巨噬細胞的炎癥反應。到6小時，反應轉向碳水化合物代謝和免疫調節通路，特別是與百日咳相關的反應，表明從代謝適應向主動抗菌防御的轉變。這種時間進程表明，CRISPR陣列30.1的刪除不僅解除了對細菌的代謝限制，還破壞了宿主-病原體平衡的正常動力學，導致加速的炎癥激活和細菌典型免疫逃逸能力的喪失。

SPA分析鑒定了CRISPR陣列30.1間隔子對全基因組的自身靶向，包括關鍵操縱子上游的基因和基因間區。與基于應激反應通路的預期相反，tRNA修飾成為主要的靶向類別，占所有間隔子靶標的29.41%，其次是翻譯延伸占14.71%。這兩個類別合計占對蛋白質合成機制調控重點的44%以上。這種定量分布直接解釋了觀察到的核糖體通路富集，在間隔子靶向和轉錄組結果之間建立了清晰的機制聯系。硒代謝在靶向通路中顯示出最高的統計學富集，表明CRISPR陣列30.1特異性地限制了硒依賴過程，這對于牙周環境中的厭氧代謝和氧化應激反應可能至關重要。硒以硒代半胱氨酸的形式摻入硒蛋白中，對細菌的各種生理功能（包括氧化還原穩態和抗氧化防御）至關重要。

值得注意的是，我們觀察到間隔子介導的對VI-B型系統cas基因座的靶向，表明對CRISPR免疫的自我調控以及不同CRISPR-Cas系統之間的串擾。系統間相互作用已有記載，例如在柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）中，VI-B型系統從II-C型系統捕獲間隔子，從噬菌體和宿主基因組DNA中獲取間隔子。類似地，在沙雷氏菌（Serratia）中，I型和III型系統合作共享間隔子，增強了整體細菌免疫力。

我們研究中確定的靶標還包括關鍵的應激反應和DNA修復基因，如UvrA、UvrD和RecQ解旋酶。UvrA通過識別DNA損傷并招募修復復合體來啟動核苷酸切除修復（NER）。UvrD解旋酶在損傷識別后解開DNA鏈，促進修復，而RecQ解旋酶有助于同源重組和DNA損傷處理。這些發現暗示了這些蛋白質在牙齦卟啉單胞菌應激管理和基因組穩定性中的保守作用。

此外，已鑒定的間隔子靶標包括與厭氧代謝適應相關的基因和操縱子，特別是鈷胺素（維生素B12）生物合成通路，這在炎癥相關牙周病期間普遍存在的營養應激條件下至關重要。CRISPR對鈷胺素合成通路的調控可能直接影響毒力，特別是通過調節牙齦蛋白酶（一種與組織破壞和免疫逃逸相關的強效毒力因子）。另外，CRISPR間隔子靶向調控蛋白，包括AraC家族轉錄調節因子。AraC樣蛋白是牙齦卟啉單胞菌中重要的調控元件，通過響應環境信號（特別是與表面結構如菌毛相關的信號）來調節基因表達，從而在細菌的適應性和毒力中扮演關鍵角色。牙齦卟啉單胞菌菌毛的產生受到由FimS和FimR組成的雙組分調節系統的明確控制。這種相互作用體現了環境感應和轉錄適應的概念，宿主對牙齦卟啉單胞菌的反應等因素意味著調控行為的動態相互作用，共同控制致病性。

值得注意的是，關于血紅素可用性觸發的DNA甲基化和基因表達變化的新見解突顯了牙齦卟啉單胞菌中復雜的調控層次。已經鑒定了差異DNA甲基化特征，這對于理解基因表達如何受營養線索調控至關重要，表明甲基化過程可能與AraC等調控蛋白交織在一起。這表明AraC家族蛋白可能是更廣泛調控網絡的一部分，不僅響應直接的環境刺激，還響應影響基因表達的表觀遺傳變化。通過靶向這些調節因子，CRISPR陣列可能協調對環境應激源和宿主免疫挑戰的反應。牙齦卟啉單胞菌以其逃避先天免疫的能力而聞名，抑制趨化因子（如IL-8）以抑制中性粒細胞募集并操縱宿主炎癥反應。

CRISPR陣列30.1的缺失逆轉了免疫逃避，放大了THP-1巨噬細胞促炎介質（IL6、IL8、TNFα、CXCL1、CXCL2）的分泌，并導致CXCL9的顯著上升（約36倍）。CXCL9是一種干擾素γ（IFNγ）應答的CXCR3配體，預計將招募效應T細胞和NK細胞，并使反應偏向Th1/M1軸，而IL6與CXCL1/CXCL2一起升高則強化了與破骨細胞生成和骨吸收相關的富含中性粒細胞的急性炎癥環境。顯著性主要出現在6小時，與通過NFκB/MAPK（針對IL6/CXCL1/2）和STAT1/IRF1應答程序（針對CXCL9）的轉錄擴增一致。綜上所述，IL6和CXCL9特征表明，CRISPR陣列30.1的缺失增強了巨噬細胞的感應，并將宿主反應轉向中性粒細胞和CXCR3介導的炎癥程序。CRISPR陣列30.1依賴的MAPK/ERK和JAK/STAT通路調控可能與牙齦卟啉單胞菌感染的上皮細胞中報告的致癌過程相交。

有趣的是，TNF-α在野生型和突變株之間沒有顯著差異。未來剖析單個間隔子-靶標對的研究對于闡明CRISPR介導的分泌型毒力因子調控如何影響宿主-病原體動力學至關重要。

我們的發現與轉座子測序數據互為補充，這些數據證明了I型、III型和VI型Cas系統在上皮定植和體內膿腫形成中的重要作用。這些結果強烈表明，牙齦卟啉單胞菌利用多種CRISPR系統（包括不編碼的陣列）來微調其致病策略。

這項研究使用了THP-1巨噬細胞樣細胞和大蠟螟感染模型，雖然穩健且信息豐富，但并未完全復制人類牙周病。盡管SPA有效地鑒定了間隔子靶標，但轉錄抑制的決定性證據還需要額外的靶向報告基因或CRISPR干擾（CRISPRi）實驗。未來的研究將側重于測試CRISPR陣列30.1與UvrA基因之間的相互作用，因為后者在DNA修復和應激反應通路中具有重要作用。這種靶向方法將為后續實驗提供信息，并闡明該過程中涉及的調控機制。

本文提出的結果顯著增強了我們對牙齦卟啉單胞菌如何利用CRISPR-Cas系統操縱宿主免疫反應的理解。值得注意的是，CRISPR陣列30.1的缺失導致炎癥細胞因子釋放的放大和支持巨噬細胞極化轉變的基因表達譜，標志著促炎反應的增強，這可能破壞宿主防御機制與病原體持久性之間的平衡。這種對免疫信號的操縱是牙齦卟啉單胞菌致病性的一個標志，并暗示了CRISPR介導的調控在免疫調節中更廣泛的作用。其他口腔病原體也報告了CRISPR類似的免疫調節功能。因此，缺失cas3基因的變形鏈球菌（S. mutans）UA159菌株不僅顯示出胞外多糖（EPS）產生和生物膜形成減少，而且對氟化物的敏感性增加。此外，口腔病原體可能利用CRISPR-Cas來調節微生物-微生物相互作用。福賽坦氏菌（T. forsythia）的間隔子與牙齦卟啉單胞菌（例如，甲基轉移酶基因）和齒垢密螺旋體（T. denticola）的基因具有顯著的核苷酸相似性。作者提出，牙齦卟啉單胞菌可能將其DNA遞送到其他物種的細胞中以建立生態位優勢，而福賽坦氏菌則通過將其CRISPR-Cas系統的間隔子和Cas蛋白遞送到牙齦卟啉單胞菌細胞中來攻擊其甲基轉移酶基因，以影響其持久性。

未來的研究應通過CRISPR陣列內的靶向編輯或間隔子交換來探索單個間隔子-靶標相互作用。最后，小分子抑制劑或反義寡核苷酸等破壞間隔子-靶標相互作用的治療方法為新型抗菌策略提供了令人興奮的機會。通過證明不編碼的CRISPR陣列作為毒力和宿主相互作用的主調節因子發揮作用，我們的發現顯著擴展了當前對CRISPR生物學的理解，并揭示了針對細菌病原體的治療干預新途徑。