線粒體是細胞的能量工廠，通過化學(xué)滲透機制合成ATP，其內(nèi)膜兩側(cè)存在約-140至-180 mV的電化學(xué)梯度。線粒體通過線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體復(fù)合體(mCU)快速攝取胞質(zhì)鈣離子(Ca²⁺)，適量的基質(zhì)Ca²⁺可促進ATP生成。然而，過量的基質(zhì)Ca²⁺會誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mPT)，這是一個破壞性的過程，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜(IMM)通透性增加，引起細胞死亡。mPT早在約50年前就被發(fā)現(xiàn)，但其分子機制尚未闡明，尤其是構(gòu)成通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的關(guān)鍵蛋白成分一直未知。此前，多種線粒體整合膜蛋白，如腺苷酸轉(zhuǎn)運體(ANT)、線粒體磷酸載體(PiC)、電壓依賴性陰離子通道(VDAC)以及F₀F₁ATP合酶等，曾被提議為mPTP的候選成分，但后續(xù)的基因敲除(KO)研究挑戰(zhàn)了這些觀點，因為這些蛋白的缺失并未完全阻止mPT。小分子抑制劑環(huán)孢素A(CsA)通過拮抗線粒體基質(zhì)親環(huán)素PPIF來延緩mPT，但不能完全阻止，且針對心臟保護的臨床試驗未能成功。因此，鑒定mPT的必需蛋白是理解相關(guān)疾病機制的關(guān)鍵。

本研究旨在以無偏的方式，在人類細胞中鑒定mPT的必需蛋白。研究人員選擇了具有近單倍體核型的HAP1細胞系，因其具有經(jīng)典的mPT特征，且適合遺傳篩選。首先，他們開發(fā)了兩種針對線粒體鈣超載的表型檢測方法，均適用于基于熒光激活細胞分選(FACS)的全基因組CRISPR-Cas9篩選。

第一種是線粒體膜電位(MMP)檢測法。研究人員設(shè)計了一種更亮的基于羅丹明的MMP染料JF₅₄₉M。在鈣離子載體離子霉素誘導(dǎo)的鈣超載下，MMP迅速崩潰，JF₅₄₉M熒光消失。此方法被用于全基因組CRISPR篩選，旨在富集能夠抵抗離子霉素誘導(dǎo)MMP崩潰的基因敲除細胞。2+ overload. (A) Ionomycin transiently increases matrix Ca²⁺. (C and D) Ionomycin induces mitochondrial membrane potential (MMP) collapse. Intact HAP1 cells were incubated with 25 nM JF₅₄₉M and 100 nM MitoTracker Green. Confocal images were captured before (Left) and 180 s after (Right) 10 μM ionomycin application. The fluorescence of mitochondrial particles ... was tracked over time.">

第二種是直接檢測mPT的線粒體通透性檢測法。該方法遵循mPT的原始定義：Ca²⁺超載導(dǎo)致IMM對約1,500 Da以下分子的通透性增加。研究人員設(shè)計了受體-配體熒光檢測法，在HAP1細胞中穩(wěn)定表達了線粒體靶向的HaloTag蛋白(HaloMTS)，并使用膜不通透的俄勒岡綠HaloTag配體(OG-HTL, ~600 Da)。在質(zhì)膜被洋地黃皂苷通透化后，僅當(dāng)使用mPT激動劑（Ca²⁺和巰基反應(yīng)分子苯胂氧化物PAO）處理時，OG-HTL才能進入線粒體基質(zhì)與HaloTag結(jié)合產(chǎn)生熒光。因此，在mPT激活條件下仍保持暗色的細胞，即被認(rèn)為是抵抗mPT的細胞，可用于FACS富集。2+. (G–I) Ca²⁺and thiol-reactive PAO are required to maximally activate the mPT. Flow cytometry histograms comparing 30 nM OG-HTL staining ... in control (G), 400 μM Ca²⁺(H), and 400 μM Ca²⁺+ 20 μM PAO (I).">

利用MMP檢測法進行的篩選，其陽性結(jié)果主要富集在線粒體鈣攝取通路上。統(tǒng)計顯著的15個基因中，排名前三的有SMDT1 (EMRE)、MCU和MICU1，它們都是線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體復(fù)合體的關(guān)鍵組分。這意味著離子霉素誘導(dǎo)的MMP崩潰主要是由快速、大量的線粒體鈣內(nèi)流引起的，而非直接反映mPT本身。對這批候選基因的敲除株進行鈣離子保留能力(CRC)和去偶聯(lián)劑誘導(dǎo)鈣釋放(UCR)檢測，發(fā)現(xiàn)敲除SMDT1或MCU雖能阻止鈣攝取從而無鈣釋放，但并未證明它們對mPT是必需的。其他敲除，如NF2 KO和REST KO，可增加CRC但并未阻止鈣釋放，表明它們可能只是mPT的增敏劑。沒有一個MMP篩選出的候選基因能阻止mPT介導(dǎo)的鈣釋放。2+ release is not prevented by knockout (KO) of any hit from the MMP CRISPR screen. Plot of normalized (KO/control) Ca²⁺uptake spikes before Ca²⁺release in the CRC assay.">

利用線粒體通透性檢測法進行的篩選，旨在直接尋找mPT激活的必需因子。在評估了19,113個基因后，有11個基因被顯著富集。其中排名前三的候選基因是：線粒體基質(zhì)蛋白NLRX1、已知的mPT增敏劑PPIF、以及核染色質(zhì)結(jié)合蛋白BPTF。值得注意的是，這11個基因中只有一個是明確的整合膜蛋白，而此前提出的所有mPT候選整合膜蛋白（如ANT、PiC、VDAC、ATP合酶亞基等）均未被富集。這強烈暗示整合膜蛋白并非人類mPT激活所必需的。

研究人員對通透性篩選得到的頂級候選基因進行了功能驗證。其中，線粒體基質(zhì)蛋白NLRX1的敲除展現(xiàn)出最顯著的表型。在CRC檢測中，NLRX1 KO不僅大幅增加了線粒體耐受的鈣脈沖次數(shù)，而且完全阻止了大規(guī)模的鈣釋放事件。相比之下，BPTF KO和PPIF KO雖也增加了CRC，但效果不及NLRX1 KO。更重要的是，當(dāng)使用mPT經(jīng)典抑制劑CsA處理時，NLRX1 KO細胞的CRC未再增加，且鈣釋放事件也未再被誘導(dǎo)，表明NLRX1 KO已經(jīng)使mPT對CsA不敏感，這符合“mPT激活被消除”的定義。而BPTF KO細胞對CsA仍有反應(yīng)，表明BPTF更可能是一個增敏劑。在UCR檢測中，NLRX1 KO能延遲但無法阻止去偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的鈣釋放，這可能意味著UCR與經(jīng)典的mPT機制不完全相同，或者需要更強的刺激。2+ release. (E and F) Cyclosporin A (CsA) is ineffective in NLRX1 KO.">

綜合兩項篩選的驗證結(jié)果，研究共確定了四個蛋白質(zhì)編碼基因在mPT調(diào)控中起作用：NF2、REST、BPTF和NLRX1。其中，非線粒體蛋白NF2、REST和BPTF的敲除增加了CRC，但鈣釋放仍然發(fā)生或?qū)�CsA敏感，屬于mPT增敏劑。唯有線粒體基質(zhì)蛋白NLRX1的敲除，在增加CRC的同時完全阻止了鈣釋放，并且表現(xiàn)出對CsA不敏感，符合“mPT必需激活因子”的定義。

本研究的核心發(fā)現(xiàn)是NLRX1作為mPT激活的必需因子，挑戰(zhàn)了長期以來認(rèn)為整合膜蛋白是mPT孔形成核心的觀點。NLRX1是唯一靶向線粒體的Nod樣受體(NLR)，定位于線粒體基質(zhì)并與內(nèi)膜緊密結(jié)合。此前關(guān)于NLRX1的研究多集中于其在線粒體抗病毒信號(MAVS)通路中的免疫調(diào)節(jié)功能，但定位和功能存在爭議。有研究顯示NLRX1過表達可增加活性氧(ROS)產(chǎn)生，而其敲除則降低ROS并保護細胞免受鈣離子載體誘導(dǎo)的凋亡，這與mPT被削弱的表現(xiàn)一致。在病理層面，mPT與缺血再灌注(IR)損傷密切相關(guān)。有趣的是，動物模型顯示NLRX1敲除會加重心臟和腎臟的IR損傷，這可能是因為mPT激活的缺失阻止了受損線粒體的清除，從而加劇了炎癥反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為理解NLRX1在疾病中的復(fù)雜角色提供了新視角。

研究還對mPT在不同物種間的進化意義進行了探討。mPT在哺乳動物、果蠅、酵母甚至植物中均有報道，但在一些耐缺氧的甲殼動物中似乎缺失。值得注意的是，NLRX1僅在有頜脊椎動物中出現(xiàn)，而不存在于無脊椎動物中。研究者推測，NLRX1可能與mPT一起，進化成為對短期缺氧敏感的生物體（易受IR損傷）的一種組織損傷調(diào)控機制。

關(guān)于mPT的分子本質(zhì)，本文提出了三種可能性。第一，NLRX1自身形成孔道，但其缺乏跨膜證據(jù)。第二，NLRX1作為支架蛋白，募集冗余的孔道形成復(fù)合物。第三，也是研究者更傾向的假設(shè)：NLRX1通過改變電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物（如與UQCRC2互作）的構(gòu)象，促進電子泄漏和局部ROS爆發(fā)。高濃度的ROS可導(dǎo)致內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化，從而形成瞬時的親水性脂質(zhì)孔，其直徑估算與mPT孔類似。這個“脂質(zhì)過氧化孔”模型可以調(diào)和許多現(xiàn)有矛盾：它不依賴于單一的蛋白質(zhì)孔道，可以解釋為何缺乏NLRX1的無脊椎動物mPT敏感性降低，以及為何在缺乏MCU的酵母中仍能發(fā)生mPT。

本研究存在一定局限，例如單基因敲除篩選可能遺漏冗余基因的功能，且未能評估由小開放閱讀框(sORFs)編碼的微蛋白。然而，其無偏篩選明確指出了NLRX1在人類mPT中的核心地位。這項工作不僅為理解mPT的分子機制開辟了新道路，將NLRX1確立為關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點，也為開發(fā)針對心肌梗死、中風(fēng)等缺血再灌注損傷疾病的新療法提供了潛在的干預(yù)靶點。未來的研究需要進一步闡明NLRX1精確的分子作用機制，并驗證其在多種生理病理模型中的功能。