隱孢子蟲病（Cryptosporidiosis）是一種由隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）引起的人畜共患、機(jī)會(huì)性腸道寄生蟲病，主要通過糞-口途徑傳播。在眾多蟲種中，人隱孢子蟲（C. hominis）和牛隱孢子蟲（C. parvum）是感染人類的主要病原體。該病是導(dǎo)致人類和動(dòng)物腹瀉的重要原因，可占腹瀉病例的20%，對(duì)免疫功能低下者（如艾滋病患者）威脅尤為嚴(yán)重，全球高達(dá)24%的艾滋病合并腹瀉患者受其影響。其基因組高度相似，差異僅3-5%。隱孢子蟲生活周期簡(jiǎn)單，僅需單一宿主，涉及孢子生殖、裂殖生殖、配子生殖和成囊等多個(gè)階段，感染劑量可低至10個(gè)卵囊。蟲體通過粘蛋白樣糖蛋白和血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白等介導(dǎo)對(duì)宿主腸上皮細(xì)胞的吸附，進(jìn)而入侵并引起病理變化。目前，尚無(wú)FDA批準(zhǔn)的隱孢子蟲病疫苗，治療藥物（如硝唑尼特）效果有限，尤其在免疫缺陷患者中。因此，開發(fā)有效疫苗迫在眉睫。隨著mRNA疫苗技術(shù)在抗擊SARS-CoV-2中的成功應(yīng)用以及反向疫苗學(xué)（RV）、免疫信息學(xué)的發(fā)展，使得無(wú)需實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)病原體即可通過計(jì)算機(jī)模擬快速設(shè)計(jì)候選疫苗成為可能。本研究旨在利用這些先進(jìn)方法，開發(fā)一種針對(duì)C. hominis和C. parvum的新型mRNA多表位疫苗。

研究遵循一套系統(tǒng)的in-silico（計(jì)算機(jī)模擬）流程。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取C. hominis和C. parvum的5種關(guān)鍵致病蛋白（氨肽酶、熱休克蛋白、P23蛋白、絲氨酸蛋白酶、子孢子糖蛋白）的氨基酸序列，通過多序列比對(duì)生成各自的保守序列。接著，使用免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)（IEDB）預(yù)測(cè)這些保守序列的CD8⁺T細(xì)胞（MHC-I）和CD4⁺T細(xì)胞（MHC-II）結(jié)合表位，同時(shí)使用ABCpred服務(wù)器預(yù)測(cè)連續(xù)B細(xì)胞表位。篩選標(biāo)準(zhǔn)包括百分位排名（≤1.00）、抗原性（閾值>0.4）、非過敏性及非毒性。利用IEDB的人群覆蓋率分析工具評(píng)估所選T細(xì)胞表位在全球主要人群區(qū)域的覆蓋情況。然后，將篩選出的最佳表位與佐劑（50S核糖體蛋白L7/L12）通過特定連接子（EAAAK、AYY、AK、KFER）連接，構(gòu)建出多表位疫苗序列。隨后，對(duì)疫苗蛋白進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析與驗(yàn)證：使用Expasy ProtParam分析其生物物理特性（如分子量、等電點(diǎn)pI、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)、平均親水性GRAVY等）；通過AlgPred、AllerTOP v.2.0等工具評(píng)估過敏性；通過VaxiJen 2.0和ANTIGENpro評(píng)估抗原性。使用PSIPRED、GOR4和SOPMA服務(wù)器預(yù)測(cè)疫苗的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用I-TASSER服務(wù)器進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，并通過GalaxyWEB服務(wù)器優(yōu)化，最后用SAVES v6.0（用于Ramachandran圖和ERRAT評(píng)分）和ProSA服務(wù)器（用于Z評(píng)分）驗(yàn)證模型質(zhì)量。使用Ellipro服務(wù)器預(yù)測(cè)不連續(xù)B細(xì)胞表位。分子對(duì)接方面，使用ClusPro 2.0服務(wù)器將疫苗模型與人Toll樣受體TLR-2（PDB: 2Z7X）和TLR-4（PDB: 3FXI）進(jìn)行對(duì)接，分析結(jié)合能和相互作用（鹽橋、氫鍵等）。通過MM-GBSA（分子力學(xué)廣義波恩表面積）方法計(jì)算結(jié)合自由能。利用iMODS服務(wù)器對(duì)疫苗-TLR-2和疫苗-TLR-4復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，分析其協(xié)方差、彈性網(wǎng)絡(luò)、B因子、可變形性、特征值和方差以評(píng)估復(fù)合物穩(wěn)定性。為評(píng)估表達(dá)可行性，使用Java Codon Adaptation工具對(duì)疫苗DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化（針對(duì)大腸桿菌K12表達(dá)），計(jì)算GC含量和密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI），并使用SnapGene軟件將其克隆到pET-28a(+)載體中。利用C-ImmSim服務(wù)器進(jìn)行免疫反應(yīng)模擬，預(yù)測(cè)疫苗三次注射后（時(shí)間間隔模擬為0, 28, 56天）B細(xì)胞、T細(xì)胞（輔助T細(xì)胞TH、細(xì)胞毒性T細(xì)胞TC、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞TR）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞（MA）的動(dòng)態(tài)變化以及抗體（IgM、IgG）和細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-2）的水平。最后，將疫苗序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，并使用RNAfold服務(wù)器預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和最小自由能（MFE），以評(píng)估m(xù)RNA穩(wěn)定性。

成功獲得了兩種寄生蟲五種蛋白的序列并生成了保守序列。預(yù)測(cè)并篩選出10個(gè)最佳的9肽CD8⁺T細(xì)胞表位、10個(gè)最佳的15肽CD4⁺T細(xì)胞表位以及10個(gè)最佳的連續(xù)B細(xì)胞表位，它們均具有良好的抗原性、非過敏性和非毒性。

疫苗表位對(duì)全球主要地區(qū)（南北美洲、大洋洲、歐洲、亞洲、非洲大部分地區(qū)）的合并等位基因（MHC-I和MHC-II）人群覆蓋率預(yù)計(jì)達(dá)到100%，全球總覆蓋率分別為MHC-I等位基因98.55%、MHC-II等位基因99.99%，顯示出廣泛的潛在保護(hù)范圍。

將篩選出的表位與佐劑通過特定連接子串聯(lián)，構(gòu)建了最終的多表位疫苗序列。

疫苗蛋白分子量為57570.04 Da，由523個(gè)氨基酸組成。其等電點(diǎn)pI為5.34，平均親水性指數(shù)GRAVY為-0.829，表明其為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)為38（小于40），提示其在體內(nèi)穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為53.17。多種工具預(yù)測(cè)證實(shí)該疫苗候選物具有抗原性且無(wú)致敏性。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示疫苗含有較高比例的α螺旋（GOR4: 43.02%； SOPMA: 37.67%）和無(wú)規(guī)則卷曲，以及一定比例的β折疊。三級(jí)結(jié)構(gòu)模型經(jīng)過優(yōu)化和驗(yàn)證，Ramachandran圖顯示83.1%的殘基位于最優(yōu)區(qū)，Z評(píng)分為-7.39，ERRAT評(píng)分為82.328，表明模型質(zhì)量良好。此外，預(yù)測(cè)出259個(gè)不連續(xù)B細(xì)胞表位。

分子對(duì)接顯示疫苗與TLR-2和TLR-4均有強(qiáng)烈的相互作用，最低結(jié)合能分別為-1151.9和-1028.3。MM-GBSA計(jì)算的總結(jié)合自由能分別為-63.3 kcal/mol（疫苗-TLR-2）和-70.17 kcal/mol（疫苗-TLR-4），表明結(jié)合穩(wěn)定。分子動(dòng)力學(xué)模擬分析（協(xié)方差圖、彈性網(wǎng)絡(luò)、B因子、可變形性、特征值、方差）進(jìn)一步證實(shí)了兩種復(fù)合物在生理?xiàng)l件下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和柔性。

密碼子優(yōu)化后，疫苗序列的GC含量為47.02%，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI為0.9664，預(yù)示其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可能具有高效表達(dá)潛力。成功在in-silico中將其克隆至pET-28a(+)載體。

C-ImmSim模擬顯示，接種三劑疫苗后，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答：B細(xì)胞數(shù)量顯著增加并長(zhǎng)期保持活性；輔助性T細(xì)胞（TH）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（TC）活性增強(qiáng)并持續(xù)近一年；記憶B細(xì)胞和T細(xì)胞持續(xù)存在；抗體（IgM和IgG）水平持續(xù)上升；并激活了IFN-γ和IL-2等關(guān)鍵細(xì)胞因子。

預(yù)測(cè)的疫苗mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能（MFE）為-388.70 kcal/mol（最優(yōu)結(jié)構(gòu)）和-250.50 kcal/mol（中心結(jié)構(gòu)），表明其具有較好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，有利于在宿主體內(nèi)的遞送、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

本研究利用反向疫苗學(xué)和免疫信息學(xué)，成功設(shè)計(jì)出一種靶向C. hominis和C. parvum五種關(guān)鍵蛋白保守表位的新型mRNA疫苗候選物。與既往類似研究相比，本研究靶向蛋白數(shù)量較多且針對(duì)兩種主要致病蟲種，具有一定新穎性。疫苗設(shè)計(jì)涵蓋了可激活細(xì)胞免疫（CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞）和體液免疫（B細(xì)胞表位）的多重表位，并顯示出極高的全球人群覆蓋率。生物物理分析和結(jié)構(gòu)模型驗(yàn)證表明該候選疫苗具有親水性、穩(wěn)定性、良好的抗原性和無(wú)致敏性。與先天免疫關(guān)鍵受體TLR-2和TLR-4的強(qiáng)效對(duì)接及后續(xù)的MM-GBSA、分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，從能量和構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的角度證實(shí)了其相互作用的穩(wěn)定性與強(qiáng)度，這是疫苗發(fā)揮免疫刺激作用的重要基礎(chǔ)。密碼子優(yōu)化和克隆模擬為后續(xù)的體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。免疫模擬結(jié)果令人鼓舞，預(yù)測(cè)疫苗能激發(fā)廣泛而持久的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化、增殖與記憶形成，以及抗體和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)為其實(shí)際應(yīng)用提供了又一支持。然而，本研究完全是計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)，存在固有局限性，如缺乏長(zhǎng)期免疫力預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可能存在誤差、未考慮佐劑相互作用的復(fù)雜性、未經(jīng)驗(yàn)證的蛋白穩(wěn)定性、潛在的意外過敏原性或毒性等。因此，該候選疫苗的有效性、安全性和長(zhǎng)期保護(hù)效果必須通過后續(xù)的臨床前實(shí)驗(yàn)（體外和動(dòng)物模型）以及嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過整合反向疫苗學(xué)、免疫信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)工具，設(shè)計(jì)出一種針對(duì)人隱孢子蟲和牛隱孢子蟲的新型mRNA多表位候選疫苗。In-silico分析表明，該疫苗候選物具有良好的生物物理特性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、與TLR-2/TLR-4的高親和力、廣泛的人群覆蓋率以及激發(fā)強(qiáng)效且持久的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答的潛力。這些結(jié)果為開發(fā)首個(gè)用于防治隱孢子蟲病的mRNA疫苗提供了重要的理論依據(jù)和設(shè)計(jì)藍(lán)圖。盡管結(jié)果充滿希望，但必須認(rèn)識(shí)到這僅是研發(fā)的第一步，未來(lái)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)于將這一計(jì)算模型轉(zhuǎn)化為實(shí)際可用的疫苗至關(guān)重要。