中風是全球范圍內導致死亡的第二大原因。缺血性中風會誘導活性氧（ROS）產生，從而觸發一系列炎癥因子級聯反應，最終導致炎癥反應。先前研究表明，維持最佳水平的銅離子可有效減輕與中風損傷相關的組織損傷和炎癥。銅是大腦中眾多生理過程必需的微量元素�；謴痛竽X銅平衡已被證明可在多種動物疾病模型中防止慢性神經退行性變。例如，以銅缺乏為特征的孟克斯�。∕enkes disease）會導致進行性神經功能惡化，通常在3歲前死亡。

銅缺乏也與缺血性中風有關。缺血狀態會減少線粒體ATP的產生，從而損害銅的遞送。銅不足會降低血管彈性，增加缺血事件的風險。相反，增加銅攝入量與中風風險降低相關。這些發現凸顯了開發有效的銅遞送系統以治療銅缺乏相關疾病的迫切需求。

目前已開發出幾種補充銅的策略，例如，親水性銅復合物（如銅-組氨酸）可通過腸胃外給藥來恢復銅水平和酶活性。然而，它們對神經病理的治療效果有限，主要原因是腦滲透性差。銅(II) 二乙�；�-雙(4-甲基-3-縮氨基硫脲)（Cu(II)-ATSM）具有在缺氧條件下釋放外源性結合的銅，并能從循環中快速清除（半衰期22.4分鐘）的能力。Cu(II)-ATSM具有增加的血腦屏障（BBB）滲透性和跨越BBB的能力。因此，⁶⁴Cu-ATSM能增強BBB的穿透。阿爾茨海默病小鼠模型被用來測試⁶⁴Cu-ATSM的效果，該物質可穿過BBB并遞送至下丘腦。⁶⁴Cu-ATSM在PET成像中的應用使得獲取有關腫瘤氧合（缺氧）的寶貴臨床數據成為可能，從而有助于更準確地預測實體瘤患者的治療反應和生存時間。同時，⁶⁴Cu-ATSM在日本已完全被用作一種治療診斷劑。盡管⁶⁴Cu-ATSM作為一種放射治療診斷劑顯示出潛力，但目前仍在研究新的銅基化合物以增強診斷能力，特別是在涉及銅代謝異常的情況下。

埃列克沙莫（Elesclomol， ES）最初是作為轉移性黑色素瘤的化療藥物開發的，最近因其銅轉運能力而受到關注。ES與細胞外Cu(II)離子形成復合物（Cu(II)-ES），該復合物在線粒體內被還原為Cu(I)，在此過程中產生ROS。這種機制使ES成為缺氧條件下潛在的銅遞送載體。將ES與⁶⁴Cu偶聯，類似于ATSM，為通過PET無創成像銅轉運提供了獨特的機會。

在本研究中，我們探究了ES是否能夠有效地將銅遞送至缺血腦組織。我們使用⁶⁴Cu作為替代示蹤劑，通過PET成像可視化銅的轉運過程。將ES用⁶⁴Cu放射性標記后，我們通過PET成像和離體生物分布分析評估了⁶⁴Cu-ES在正常C57BL/6J小鼠中的藥代動力學。此外，在正常和缺血性斯普拉格-道利（Sprague–Dawley， SD）大鼠中進行了PET成像，以評估⁶⁴Cu-ES在腦組織中的可及性和特異性。

ES和ATSM分別購自TargetMol和ABX Advanced Biochemical Compounds。放射性標記程序按照先前報道的方案進行。⁶⁴Cu通過HM-10HC+回旋加速器生產，通過轟擊⁶⁴Ni并用1 mol/L超純鹽酸洗脫收集⁶⁴CuCl₂。將20 μg的ES或ATSM溶解在20 μL DMSO和80 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L， pH = 4.1）中。然后將該溶液與100 μL的⁶⁴CuCl₂溶液（在醋酸-醋酸鈉緩沖液中為1 mCi， 0.1 mol/L， pH = 4.1）混合。放射性標記反應在80°C下進行10分鐘。使用Sep-Pak C18固相萃取柱純化標記的復合物（⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM）。通過放射性反相HPLC（島津，日本京都）分析配體和復合物的純度以及復合物的放射化學純度。

將⁶⁴Cu-ES或⁶⁴Cu-ATSM與小鼠血清在37°C溫和振蕩下孵育1、2和4小時。使用配備C18柱的radio-HPLC儀器分析樣品以評估體外穩定性。根據HPLC保留時間和放射化學純度確定穩定性曲線。

所有動物實驗均獲得中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所動物倫理委員會批準。本研究使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。所有程序均按照機構動物護理和使用委員會的指南進行。

通過將⁶⁴Cu-ES或⁶⁴Cu-ATSM在正辛醇和磷酸鹽緩沖液（PBS， 0.1 mol/L， pH 7.4）之間分配來評估脂溶性。將等體積的化合物和每種溶劑在試管中混合，充分渦旋，并在室溫下以4000 rpm離心5分鐘。小心分離上層（正辛醇）和下層（PBS）相并稱重。使用伽馬計數器測量各層的放射性。Log P值計算為 log[cpm/g(正辛醇)]/[cpm/g(PBS)]。

根據先前發表的方案建立缺血模型。采用血管內線栓法阻斷大腦中動脈30分鐘誘導短暫性局灶性缺血。簡而言之，用4%異氟醚麻醉SD大鼠，并用1.8%異氟醚維持麻醉。將涂有硅膠的4-0單絲尼龍線通過頸內動脈插入至大腦中動脈分叉處（約16–18 mm）。用絲線縫合切口。在閉塞30分鐘并從麻醉中恢復后，再次麻醉大鼠，并撤出線栓以允許再灌注。在整個過程中仔細監測并維持體溫在生理范圍內。

對于正常C57BL/6J小鼠，通過尾靜脈注射給予每只小鼠3.7 MBq的⁶⁴Cu-ES或⁶⁴Cu-ATSM。在注射后（p.i.）60分鐘內進行動態PET/CT掃描。對于⁶⁴Cu-ES，在注射后0.5、5、15、30、45和60分鐘采集圖像；對于⁶⁴Cu-ATSM，在注射后0.5、1.5、2.5、5、45和60分鐘采集圖像。

在正常和缺血SD大鼠中，靜脈注射每只大鼠37 MBq的⁶⁴Cu-ES。在注射后1、4、20和24小時進行PET成像，以評估示蹤劑在缺血組織中的分布和滯留情況。

正常C57BL/6J小鼠通過靜脈注射接受每只小鼠1.85 MBq的⁶⁴Cu-ES或⁶⁴Cu-ATSM。在異氟醚麻醉下，于注射后5、30、60和120分鐘處死小鼠。取出主要器官（包括腦、心、肺、肝和腎）并稱重。使用伽馬計數器測量每個器官的放射性。計算每克組織注射劑量的百分比（%ID/g），并校正衰變。

本研究主要采用描述性統計分析。數據表示為平均值±標準差，源自至少三次獨立實驗。使用GraphPad Prism 10軟件通過未配對的Student t檢驗進行統計學比較。P值<0.05被認為具有統計學意義。

在本研究中，使用⁶⁴Cu作為替代物來可視化埃列克沙莫將銅離子轉運至大腦的過程。選擇⁶⁴Cu-ATSM作為對照，因為它是成熟的缺氧放射治療診斷劑，并且與ES具有相似的化學結構。⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM的放射性標記均獲得了高放射化學純度、產率和穩定性。脂溶性分析顯示⁶⁴Cu-ES的Log P值為1.38，而⁶⁴Cu-ATSM為-0.24。在制劑后長達4小時內，未觀察到任一化合物在小鼠血清中發生分解，證實了它們的血清穩定性。

64Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM. (A) Chemical structures of ⁶⁴Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM. (B) Radiosynthesis of ⁶⁴Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM. (C) Lipophilicity evaluations showing Log Pvalues of ⁶⁴Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM. Stability analysis of (D) ⁶⁴Cu-ES and (E) ⁶⁴Cu-ATSM in mouse serum.">

進行動態PET/CT成像研究以評估藥代動力學特征。將⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM靜脈注射至正常C57BL/6J小鼠體內，并比較它們的腦攝取。PET/CT成像揭示了⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM在小鼠腦內的動態攝取模式存在顯著差異。對于⁶⁴Cu-ES，攝取顯示出明顯的時間依賴性增加，在注射后0.5分鐘時略低，隨后穩步上升。值得注意的是，從注射后5分鐘開始，⁶⁴Cu-ES在整個大腦中顯示出強烈的攝取，表明其能有效穿透血腦屏障。相比之下，⁶⁴Cu-ATSM在0.5分鐘時迅速在全腦累積，但在2.5分鐘后迅速下降，在5分鐘時主要定位在前腦區域，并在1小時后幾乎消失。

64Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM. (A) PET/CT images of ⁶⁴Cu-ES and ⁶⁴Cu-ATSM in C57BL/6J mice. (B) Dynamic PET quantification of brain uptake within 1 h.">

對1小時內動態PET掃描的興趣區域（ROI）攝取進行定量分析證實了這些差異。⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM在腦、心、肝、肺和腎在不同時間點的攝取顯示在補充材料中。肝臟的攝取保持相對恒定，而在心臟和肺部觀察到顯著差異：與⁶⁴Cu-ATSM相比，⁶⁴Cu-ES在心臟和肺部的放射性分別高出2.5倍和10倍。腦攝取趨勢與PET/CT結果一致，⁶⁴Cu-ES的攝取在1小時內從4.83 %ID/cc增加到7.63 %ID/cc，而⁶⁴Cu-ATSM則從8.54 %ID/cc下降到1.63 %ID/cc。

離體生物分布進一步凸顯了兩種化合物之間的差異。兩種示蹤劑均在肝臟、肺部和腎臟觀察到高放射性積聚。然而，⁶⁴Cu-ES在心臟的攝取明顯更高。最顯著的差異出現在大腦中。雖然⁶⁴Cu-ATSM顯示出相對較高的早期攝取（約3.55 %ID/g），但在注射后2小時時下降至1.10 %ID/g。相反，⁶⁴Cu-ES的攝取在同一時期從1.80 %ID/g上升到4.23 %ID/g，這與PET發現一致。與⁶⁴Cu-ATSM相比，⁶⁴Cu-ES在腦內滯留時間延長可能歸因于其更高的脂溶性。其他器官的攝取兩者相似。

基于其優于ATSM的滯留能力，我們選擇ES作為向腦內遞送銅的候選物。正常SD大鼠中的PET研究證實⁶⁴Cu-ES可以跨越血腦屏障，因為清晰檢測到了放射性信號。在正常SD大鼠中評估了⁶⁴Cu-ES在腦區的分布。注射后9天獲得的平均PET圖像顯示其在大腦中廣泛攝取，特別是在中腦和前腦，包括大腦皮層、紋狀體和海馬等區域。

對1小時內動態PET掃描的ROI攝取進行定量分析顯示，扣帶皮層的攝取最高，其次是紋狀體、大腦皮層、海馬、丘腦和腦橋。小腦和杏仁核的攝取最低。值得注意的是，缺血性中風會導致紋狀體、大腦皮層和海馬損傷，通常導致藥物攝取相對較高。因此，這些區域由于高能量需求、密集的線粒體含量和高NADH水平，便于將Cu(II)還原為Cu(I)并促進滯留，常被用于缺血和缺氧的研究。

為了研究⁶⁴Cu-ES對缺血區域的可及性和特異性，在大腦中動脈閉塞（MCAO）SD大鼠（一種廣泛使用的缺血性中風模型）中進行了PET成像。代表性PET圖像展示了⁶⁴Cu-ES在不同時間點在缺血大腦中的分布，證實了其腦攝取。定量PET分析顯示，在注射后24小時內，缺血側和非缺血側的攝取是均勻的。在最初一小時的動態掃描中也觀察到類似的模式。

我們還評估了⁶⁴Cu-ES在紋狀體、大腦皮層和海馬的區域攝取。PET成像顯示缺血半球和非缺血半球之間沒有顯著差異，時間-放射性曲線在所有三個區域都顯示出一致的趨勢，反映了全腦行為。

線粒體中銅代謝障礙是與線粒體能量功能障礙相關的最常見先天異常之一。迄今為止，尚無有效的治療方法。先前為治療目的而直接補充銅的嘗試均未成功，這可能與系統銅穩態的嚴格調控特性有關。這凸顯了對改進的銅遞送載體進行開發的迫切需求。

缺血性中風以腦血流中斷為特征，仍然是全球范圍內導致死亡和長期殘疾的主要原因。腦缺血誘導的缺氧條件會破壞線粒體功能，從而損害大腦中的銅代謝。早期研究表明，Cu(II)-ATSM可以減少缺血性中風小鼠模型的病變體積并改善神經功能結果。ES與ATSM具有相似的核心結構，已在多項臨床試驗中進行了評估，并顯示出良好的毒性特征。然而，缺乏直接證據證實ES可以遞送至缺血病灶。

在本研究中，我們使用了正電子發射放射性核素⁶⁴Cu，其半衰期為12.7小時，適用于診斷性PET成像和治療診斷應用。我們用⁶⁴Cu對ES和ATSM進行了放射性標記，并全面表征了放射化學性質。在結構上，ES與ATSM的不同之處在于用苯環取代了甲基。ES是一種具有雙（硫代酰肼）酰胺結構的化合物。它能以1:1的比例結合銅。具有更長鏈的ES比ATSM具有更大的分子量和更緊湊、更剛性的分子構象。值得注意的是，ES對銅(II)離子表現出極高的親和力，其結合親和力值為10²⁴mol/L。ES通過四個孤對電子的捐贈與Cu (II)離子形成穩定的復合物。這使得結構更具疏水性，從而增加了疏水性并增強了BBB的穿透能力。銅-ES復合物具有更大的分子回轉半徑和更復雜的構象。Cu(II)和ES之間形成了強鍵，預計Cu(II)從復合物中解離緩慢，這顯著延遲了在腦組織內的釋放并阻礙了清除，導致滯留時間延長。值得注意的是，PET成像顯示兩種示蹤劑的分布模式不同：⁶⁴Cu-ATSM主要集中在前腦區域，而⁶⁴Cu-ES隨著時間的推移在整個大腦中顯示出更彌散的攝取。這些數據與先前的報告相符。此外，這些發現與先前認為⁶⁴Cu-ATSM在血液中迅速解離并僅通過銅代謝途徑被攝取的假設形成對比。相反，我們的數據表明配體結構本身在藥代動力學中起著重要的功能作用。

從機制上講，在進入細胞后，Cu(II)-ES進入線粒體，隨后在還原為銅(I)后釋放銅，該反應很可能由線粒體鐵氧還蛋白1介導。釋放到線粒體中的銅(I)可以與分子氧發生反應，產生ROS。這些分子過量可導致無法控制的氧化應激，并最終通過凋亡導致癌細胞死亡。新出現的證據表明，ES的作用也可以通過一種新的細胞程序性死亡模式來解釋，即銅死亡（cuproptosis），它是由銅介導的細胞毒性應激引發的，這種應激源于銅與三羧酸循環中硫辛酰化酶的直接結合。盡管⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM具有相似的細胞攝取機制，但在離體生物分布中觀察到的差異很可能源于它們不同的化學性質。ES增加的脂溶性增強了組織滲透性并有助于延長滯留。相反，ATSM從腦組織中的快速清除可能限制了其在缺血條件下的應用。

銅是許多關鍵神經功能所必需的微量元素。ES和ATSM都能形成穩定的、脂溶性的、電中性的Cu(II)復合物，可以有效穿過細胞膜和血腦屏障。Cu(II)-ATSM已被廣泛報道為治療中風和其他急性腦損傷的有前途的治療劑。然而，在我們的研究中，⁶⁴Cu-ES在腦組織中顯示出明顯更長的滯留時間。因此，我們評估了其作為ATSM替代品在缺血性疾病中遞送銅的潛力。

我們的PET成像數據證實，注射⁶⁴Cu-ES后，示蹤劑有效地遞送至大腦的兩個半球，包括缺血區域。在缺血損傷的早期階段，受影響半球的⁶⁴Cu-ES攝取與對側（非缺血）側相當。這一觀察結果表明，ES成功恢復了缺血區域的銅水平，支持了其作為中風治療銅遞送載體的潛力。

然而，這項工作存在一些局限性。一方面，我們證明了ES可能是一種潛在的中風協同遞送載體，然而缺乏功能性結果的驗證，特別是Cu-ES在治療缺血性中風中的結果和機制，包括神經保護、減小梗死面積和行為恢復。這將有力地支持ES介導的銅遞送在中風模型中的作用。這部分內容的缺失是本手稿的一個局限性，我們將建議將其作為未來研究的方向。另一方面，盡管ES在缺血性中風大鼠模型中顯示出對銅遞送的一些效果，但其轉化應用于人類患者仍然面臨一系列根本性挑戰。這些挑戰主要源于物種間深刻的生理和病理生理差異，特別是銅代謝、BBB特性以及潛在毒性的差異。

首先，不同物種之間在銅代謝和穩態方面存在差異。人體擁有更為復雜和精細的銅穩態系統。銅吸收、轉運、儲存或排泄任何階段的差異都可能導致ES-Cu在人體內的半衰期、組織分布和生物利用度與動物模型相比存在顯著不同。腦缺血會引發全身應激反應，包括微量元素代謝的紊亂。動物模型無法完全復制人類患者的復雜性，特別是那些患有多重合并癥的患者。這些因素顯著改變了銅代謝，增加了治療的不確定性和風險。其次，血腦屏障是決定ES-Cu能否有效到達病變部位的關鍵因素，其物種差異是轉化過程中的主要障礙。常用嚙齒動物模型的BBB與人類相比在結構和功能上存在差異。在實驗性腦缺血模型中（通常通過機械或藥理學方法誘導），BBB破壞的程度、時間和模式可能與實際人類缺血性中風中所觀察到的不同。這種差異可能導致對ES-Cu跨越BBB的轉運效率的過高或過低估計。第三，短期動物研究可能無法充分揭示ES-Cu的長期毒性，例如慢性器官積累（特別是在肝臟、腎臟和角膜）或對認知功能的潛在影響。鑒于實驗室動物的壽命較短，某些延遲的神經毒性可能未被發現。ES-Cu可能誘發溶血、肝毒性、腎毒性等不良反應。這些人類器官對毒性的敏感性與嚙齒動物不同，使得從動物數據外推的最大耐受劑量對人類可能不準確。

此外，通過先進的光譜技術識別大腦中的銅物種是闡明Cu-ES作用機制的關鍵一步，這將成為我們未來研究的核心重點之一。

在本研究中，我們探究了ES作為一種銅遞送劑將銅轉運至大腦的能力。用⁶⁴Cu進行放射性標記后，我們成功合成了⁶⁴Cu-ES和⁶⁴Cu-ATSM。體內和離體研究均證明，與⁶⁴Cu-ATSM相比，⁶⁴Cu-ES在大腦中表現出更長的滯留時間。PET成像證實，ES能夠將銅遞送至中風SD模型大鼠的缺血大腦中，并且這種遞送不受缺血損傷的影響。這些發現支持了ES作為缺血性中風治療策略的潛力。