《ACS Sensors》：Colorimetric Sensing of MicroRNAs in Whole Blood for Early Diagnosis of Heart Failure
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本文介紹了一種名為CQmiR的創(chuàng)新性即時檢測(POC)技術(shù)，它通過比色環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)反應(yīng)，在非臨床環(huán)境下快速、定量檢測全血中的MicroRNA(miRNA)，用于心力衰竭(HF)的早期診斷。該技術(shù)實現(xiàn)了單核苷酸特異性與亞飛摩爾(10-15M)級靈敏度，并通過小鼠模型驗證了其利用9-miRNA特征譜預(yù)測心衰風(fēng)險的潛力。
引言
心力衰竭(HF)以其高發(fā)病率、致殘率和死亡率，成為65歲以上成年人最常見的住院原因。隨著人口老齡化，越來越多的人面臨心衰風(fēng)險，這加大了對癥狀前風(fēng)險分層和監(jiān)測的需求。研究表明，microRNA(miRNA)作為非編碼、約22個核苷酸長度的單鏈RNA分子，在RNA沉默和基因調(diào)控中扮演重要角色，并作為新型生物標(biāo)志物展現(xiàn)出心衰預(yù)后潛力。然而，由于其長度短、濃度低且不同家族成員間序列高度相似，miRNA的檢測極具挑戰(zhàn)。現(xiàn)有技術(shù)如Northern印跡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、微陣列和RNA測序等方法，普遍存在昂貴、耗時且無法在非臨床環(huán)境中使用的局限。因此，開發(fā)一種能在非臨床環(huán)境（如家庭或床旁）下進行、簡單可靠、高靈敏度與特異性的miRNA檢測方法，對于心衰的早期診斷和健康管理至關(guān)重要。
技術(shù)原理：基于PCR的比色miRNA傳感技術(shù)(CQmiR)
本研究開發(fā)的CQmiR技術(shù)，其流程主要分為三個部分：miRNA分離、可視化啟動和LAMP擴增。核心技術(shù)在于使用p19(一種病毒雙鏈RNA結(jié)合蛋白)功能化的硅納米探針貼片，從全血樣本中高效分離特異性miRNA。檢測時，向血樣中加入特異性捕獲探針，與目標(biāo)miRNA雜交形成雙鏈RNA(dsRNA)。隨后，這些dsRNA雙鏈體被納米探針表面固定的p19蛋白選擇性捕獲，而未結(jié)合的分子和單鏈RNA則被洗去。LAMP模板序列設(shè)計用于與捕獲探針的10個核苷酸突出端雜交，進而啟動LAMP反應(yīng)。如果目標(biāo)miRNA存在，反應(yīng)會產(chǎn)生質(zhì)子，導(dǎo)致pH從中性變?yōu)樗嵝浴＿@一變化可通過pH顏色指示劑（酚紅）可視化，顏色從粉紅色變?yōu)辄S色（pH 6.8時）。通過監(jiān)測反應(yīng)速度（即顏色變化所需時間），可對目標(biāo)miRNA進行定量分析。
得益于納米探針貼片顯著增大的表面積和垂直結(jié)構(gòu)，其miRNA捕獲能力比平面貼片高出約6倍。該生物芯片在4°C下儲存5天后仍保持功能，并可實現(xiàn)多達20個再生循環(huán)，同時保持良好的捕獲效率和穩(wěn)定性。
定量傳感與性能分析
1. 定量傳感可行性驗證
研究首先使用預(yù)先設(shè)計的寡核苷酸模板和商業(yè)比色LAMP試劑盒驗證了比色定量傳感的可行性。通過智能手機記錄反應(yīng)過程視頻，在CIELAB顏色空間中分析顏色變化。結(jié)果顯示，隨著LAMP模板濃度從100 pM降至1 fM，反應(yīng)的激活時間（顏色從粉紅變?yōu)辄S色的時間點）從約19分鐘增加至35分鐘。該方法的檢測限(LOD)低至1.26 × 10-16M，證明了基于CIELAB模型的比色方法能有效獲得定量傳感結(jié)果。
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2. 檢測靈敏度與特異性
接下來，研究驗證了CQmiR在磷酸鹽緩沖液(PBS)和全血中檢測外源性加入的心衰相關(guān)miRNA（以let-7a為例）的能力。結(jié)果表明，目標(biāo)miRNA濃度與反應(yīng)時間之間存在顯著的負相關(guān)線性關(guān)系。在PBS中，miRNA濃度從10 pM降至100 aM時，激活時間從18.2±0.75分鐘增加至34.0±0.89分鐘，LOD為1.73 × 10-17M。在全血中，LOD為2.26 × 10-17M，動態(tài)范圍約為5-6個數(shù)量級，表明該技術(shù)在全血環(huán)境中同樣有效。
特異性測試顯示，只有當(dāng)目標(biāo)miRNA與其完全互補的誘餌序列結(jié)合時，才會產(chǎn)生陽性反應(yīng)（B ? kA > 0），而錯配的誘餌序列則保持陰性。重要的是，對于序列僅有一個核苷酸差異的let-7a、let-7b和let-7c家族成員，CQmiR也能有效區(qū)分，實現(xiàn)了單核苷酸特異性，假陽性率僅為0.44%。
2=0.975。(c) 小提琴圖顯示全血中目標(biāo)miRNA濃度與LAMP反應(yīng)激活時間的關(guān)系，R2=0.973。">
在嚙齒動物模型中預(yù)測心力衰竭
為了驗證CQmiR檢測心衰miRNA的可行性，研究建立了異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的小鼠心衰模型。通過Masson三色和H.E.染色，以及基于硅貼片的熒光免疫法檢測B型利鈉肽(BNP)水平，確認了模型可靠性。14天ISO注射組小鼠的BNP水平顯著升高，心肌細胞排列紊亂、細胞核溶解、炎性細胞浸潤，并伴有膠原纖維沉積明顯增加，表明其處于心衰狀態(tài)；7天ISO注射組則被視為心衰前狀態(tài)。
研究選取了9種與心衰相關(guān)的miRNA（miR-423-5p、let-7i-5p、miR-18a-5p、miR-223-3p、miR-301a-3p、miR-652-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p和miR-30e-5p）進行檢測。結(jié)果顯示，miR-652-3p和miR-30e-5p等miRNA的表達水平在不同組別間存在顯著差異，能夠有效區(qū)分心衰組與非心衰組。
為了進行穩(wěn)健的風(fēng)險分層，研究對CQmiR測量的miRNA數(shù)據(jù)應(yīng)用了t-SNE可視化和決策樹分類器。t-SNE圖顯示，三個實驗組的小鼠形成了三個不同的簇，其中7天ISO注射組位于14天ISO注射組和正常組之間，表明該miRNA特征譜可以在BNP水平升高及組織病理學(xué)變化之前，更早地檢測到7天ISO誘導(dǎo)的心衰前狀態(tài)。決策樹模型經(jīng)過訓(xùn)練，對小鼠心衰風(fēng)險的總體分類準確率達到88.89%。模型的特征重要性分析顯示，miR-652-3p的評分貢獻了39.93%，miR-30e-5p的評分貢獻了其余部分，這兩者被確定為最重要的預(yù)測特征。通過對未知樣本的測試，模型可以依據(jù)其miR-652-3p和miR-30e-5p的評分，準確地預(yù)測其屬于心衰風(fēng)險組還是正常組。
討論與結(jié)論
心力衰竭是一種逐漸惡化的疾病，及時的監(jiān)測有助于早期發(fā)現(xiàn)病理狀況并進行及時干預(yù)。本研究開發(fā)的CQmiR技術(shù)，利用在RNA結(jié)合蛋白(p19)功能化納米探針陣列上進行的比色LAMP反應(yīng)，能夠在非臨床環(huán)境下（例如家庭環(huán)境）約2小時內(nèi)完成，并利用低成本試劑實現(xiàn)快速miRNA檢測。該技術(shù)通過監(jiān)測反應(yīng)單元顏色變化的時間來測量全血中目標(biāo)miRNA的濃度。在小鼠心衰模型中，研究使用一組九種miRNA驗證了CQmiR平臺。基于CQmiR量化miRNA水平訓(xùn)練的決策樹分類器，能夠準確地對小鼠進行心衰風(fēng)險分層，準確率達88.9%，并確定了miR-652-3p和miR-30e-5p為兩個最重要的預(yù)測特征。
與當(dāng)前臨床金標(biāo)準（如血漿或血清NT-proBNP和BNP）相比，CQmiR平臺能夠直接使用未處理的全血，并能在癥狀出現(xiàn)前（如ISO注射7天后）檢測到分子水平的失調(diào)，顯示出早期預(yù)警潛力。本研究中識別的特定miRNA，如miR-652-3p和miR-30e-5p，已被獨立證實與早期心肌細胞應(yīng)激、炎癥和纖維化相關(guān)，且先于利鈉肽的顯著升高。與單一miRNA生物標(biāo)志物相比，多重特征譜方法進一步提高了特異性。
盡管概念驗證是在嚙齒動物模型中完成的，但該技術(shù)展現(xiàn)出作為一種互補性、超低成本、真正無需設(shè)備的篩查工具的潛力，適用于缺乏實驗室基礎(chǔ)設(shè)施和血漿分離條件的早期非臨床或資源有限環(huán)境。將其轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，后續(xù)需要在大型人類隊列中進行前瞻性臨床驗證。人工智能(AI)與生物傳感和移動診斷的整合，有望進一步提升CQmiR的診斷能力，通過分析個體健康數(shù)據(jù)實現(xiàn)個性化診療，改善醫(yī)療結(jié)果。
