研究旨在開發一個集成工作流程，以研究蛋白質的原子構象和動力學。理解原子結構固然重要，但探索蛋白質動力學（如折疊和相互作用過程）同樣關鍵，因為這些直接影響其生物學功能。高速原子力顯微鏡（HS-AFM）能夠在溶液環境中提供蛋白質功能過程中其動力學和表面結構變化的洞察。盡管HS-AFM具有高時間分辨率，但它缺乏其他實驗技術（如X射線晶體學或冷凍電子顯微鏡（cryo-EM））的原子空間分辨率。因此，原子力顯微鏡（AFM）面臨的主要挑戰之一在于如何將其低分辨率的三維表面圖像解釋為詳細的三維原子構象。

我們方法的核心在于結合了多種技術：HS-AFM、AFMfit（一種擬合AFM圖像的方法）、非線性正常模式分析（NMA）和分子動力學（MD）模擬，從而建立起SimHS-AFMfit-MD流程（如圖1所示）。該工作流程包括四個關鍵步驟：（i）獲取實驗AFM圖像和蛋白質模型（PDB文件）；（ii, iii）AFM擬合（即AFMfit-NMA, AFMfit-MD）和MD模擬，以生成原子構象庫（PDB）；（iv）主成分分析（PCA），根據其主成分（PCs）對動態原子構象進行分類。通過整合這些技術，我們可以更全面地了解蛋白質的三維原子結構，以及它們在功能活動過程中的動力學和構象變化。

我們應用此方法分析了Ca²⁺結合與非結合狀態的alpha-輔肌動蛋白在毫秒到秒時間尺度上的構象變化，并確定了該蛋白質的原子構象動力學。Alpha-輔肌動蛋白是一種反向平行同源二聚體，分子量超過200 kDa。雞胗平滑肌alpha-輔肌動蛋白的結構包括以下結構域：N端肌動蛋白結合域（ABD），其中兩個鈣調蛋白同源結構域1和2（CH1, CH2）廣泛接觸；包含四個血影蛋白樣重復序列（SR1-SR4）或桿狀域的中心區域；以及C端鈣調蛋白樣結構域（CaMD），其中包含兩對EF手基序（EF12和EF34），EF12結構域負責Ca²⁺結合。兩個ABD經歷90度旋轉，使alpha-輔肌動蛋白能夠以幾乎任何方向交聯肌動蛋白絲。

首先，我們使用HS-AFM獲取了alpha-輔肌動蛋白的高時空分辨率圖像。在近生理條件下，以每幀100毫秒的成像速率連續記錄了單個Ca²⁺結合與非結合的alpha-輔肌動蛋白分子的三維分子表面圖像，這些分子通過非特異性靜電相互作用弱吸附在云母上（圖2）。從靜電角度來看，alpha-輔肌動蛋白在生理pH下攜帶大量凈負電荷（-54e），這削弱了與帶負電的云母表面的非特異性靜電吸附。成像緩沖液部分屏蔽了表面靜電相互作用，允許足夠的吸附以實現穩定成像，同時保留了構象自由度。因此，觀察到的運動處于物理合理的范圍內，內部靈活性得以保持。

我們成功捕獲了alpha-輔肌動蛋白分子在云母上的真實同源二聚體特征，其外觀與交聯肌動蛋白絲的Ca²⁺結合和非結合alpha-輔肌動蛋白的同源二聚體結構一致。這些結果表明，觀察到的構象反映了與其生物功能相關的內在結構特征。數千個alpha-輔肌動蛋白分子的構象動力學，包括彎曲和扭轉運動，在我們的AFM圖像中被成功捕獲和可視化。為了區分這兩種狀態之間的構象動力學，我們半自動地追蹤了多個alpha-輔肌動蛋白分子在連續幀中兩個相對ABD球體的位置，并計算了它們峰高之間的距離。HS-AFM分析表明，雖然alpha-輔肌動蛋白的整體長度在有無Ca²⁺存在時相似，但兩種狀態的整體高度存在顯著差異。從HS-AFM數據集來看，Ca²⁺結合alpha-輔肌動蛋白的平均高度和長度分別為5.7±0.9 nm和25.1±2.3 nm，而Ca²⁺非結合狀態分別為4.8±0.7 nm和25.0±3.2 nm。結果顯示高度分布存在統計學顯著差異，但長度在兩種狀態間無顯著差異。

我們基于HS-AFM的分析有助于闡明alpha-輔肌動蛋白的一些特性，包括其高度和長度隨時間的波動。然而，這些傳統的AFM處理技術無法揭示alpha-輔肌動蛋白原子構象動力學的關鍵見解，因為它們只提供了其表面結構。但理解這些運動對于把握alpha-輔肌動蛋白的肌動蛋白交聯功能對肌動蛋白絲結構、動力學和功能的機械影響至關重要。

因此，我們通過整合HS-AFM與AFMfit-NMA或AFMfit-MD以及MD模擬，開發了SimHS-AFMfit-MD流程。該流程包括四個步驟，使我們能夠進一步研究alpha-輔肌動蛋白的動力學和原子結構。我們利用AFMfit-NMA和AFMfit-MD將從HS-AFM獲得的alpha-輔肌動蛋白三維分子表面轉化為三維原子構象。通過這種方法，我們為Ca²⁺結合和非結合alpha-輔肌動蛋白狀態創建了原子構象庫。然后將這些構象對齊，以基于AFMfit-NMA、AFMfit-MD和MD模擬比較兩種狀態的動力學。與MD模擬相比，AFMfit-NMA分析中Cα位置的分布更廣，但AFMfit-MD與MD模擬之間的分布非常相似。值得注意的是，將MD軌跡信息整合到AFMfit（AFMfit-MD）中產生的構象庫與MD模擬生成的構象庫更為一致。基于NMA的結構擬合捕獲了Ca²⁺結合和非結合狀態之間的構象變化，這些變化與2微秒無偏MD模擬和AFMfit-MD中觀察到的結果相當。

使用均方根漲落（RMSF）來量化每個Cα原子相對于其平均位置的偏差，該指標使用了通過AFMfit-NMA、AFMfit-MD和MD模擬生成的構象庫。結果揭示了ABD內的CH1-CH2、頸部以及EF12-EF34結構域的動態運動。然而，桿狀結構域（SR1–SR4）表現出相對較高的剛性。

我們還分析了結構域間距離以及alpha-輔肌動蛋白ABD的彎曲和扭轉角度，以表征alpha-輔肌動蛋白在Ca²⁺結合和非結合狀態下的動態構象。這些分析現在可以通過我們的SimHS-AFMfit-MD框架實現。總體而言，SimHS-AFM-MD分析表明，Ca²⁺結合略微降低了肌肉alpha-輔肌動蛋白中頸部附近CH1-CH2和EF12-EF34結構域的運動。

主成分分析（PCA）是一種用于降低數據集維度同時保留其最顯著變化的統計方法。它在利用主成分（PCs）識別和分類單個蛋白質結構域的集體運動方面非常有效。

首先，我們通過分析從AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模擬獲得的構象庫，確定了Ca²⁺結合和非結合alpha-輔肌動蛋白的原子運動集合，并將這些運動投影到一個共同的PCA空間。使用主成分1（PC1）、PC2和PC3的特征值來確定每種運動對總運動的貢獻百分比。PC1（28.7%）主要捕獲了x軸上的彎曲運動集合，PC2（19.1%）代表了y軸上的彎曲運動，PC3（9.8%）描述了扭轉運動。

為了將AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模擬獲得的數據與通過冷凍電鏡（cryo-EM）和X射線衍射獲得的靜態構象（PDB: 1SJJ和4D1E）進行比較，我們將從AFMfit-NMA、AFMfit-MD、NMA和MD模擬生成的Ca²⁺結合和非結合alpha-輔肌動蛋白的構象庫投影到一個共同的PCA空間，并繪制了PC1與PC2以及PC1與PC3的分布圖。對于Ca²⁺結合和非結合狀態，來自AFMfit-NMA構象庫的PC1和PC2沿x-y軸的集體彎曲運動分布與來自AFMfit-MD和MD模擬庫的分布相當。單獨的NMA集合分布，正如預期的那樣，遵循諧波定律，并且比MD集合和AFMfit構象的分布受限得多。它仍然在某種程度上類似于非結合MD模擬的分布，但與結合狀態相比有所偏移。因此，AFMfit-NMA和AFMfit-MD構象之間的差異對于Ca²⁺結合狀態更為明顯。

我們觀察到PC3的趨勢不同，它捕獲了方法之間Ca²⁺結合和非結合狀態的扭轉運動集合。然而，與主要描述集體彎曲運動的PC1和PC2相比，PC3僅占總構象變異性的很小一部分。來自冷凍電鏡和X射線衍射的構象是靜態的，占據構象空間的不同區域，突出了HS-AFM、X射線和冷凍電鏡技術之間的方法學差異，而非直接的不一致。我們注意到，通過冷凍電鏡和X射線衍射解析的非結合肌肉alpha-輔肌動蛋白的靜態構象（PDB: 1SJJ和4D1E）也有所不同。盡管據報道肌肉alpha-輔肌動蛋白對Ca²⁺結合不敏感，但我們的HS-AFM和SimHS-AFMfit-MD分析揭示了以前無法獲得的Ca²⁺結合和非結合狀態的動態原子構象。Ca²⁺結合略微降低了肌肉alpha-輔肌動蛋白中頸部附近CH1-CH2和EF12-EF34結構域的運動。

總體而言，AFMfit-NMA捕獲了alpha-輔肌動蛋白的主要彎曲運動（PC1和PC2），與AFMfit-MD和MD模擬在Ca²⁺結合和非結合狀態下都高度一致。在PC3中觀察到的差異反映了僅占總構象方差很小一部分的次要扭轉運動。從獨立MD模擬得到的漲落曲線和主要動態模式與從SimHS-AFMfit-MD推斷的構象動力學一致，但在統計上是獨立的。因此，這種一致性為我們的方法提供了正交驗證，表明AFM衍生的擬合捕獲了物理上有意義的運動，而不僅僅是復現指導性的MD信息。

在所有結果中，SR1和SR4中由藍色箭頭表示的特征向量分量或運動幅度較小。然而，SR2和SR3中的分量幾乎沒有運動。這些結果證實了桿狀結構域的剛性，與先前的研究一致。相比之下，在ABD內的CH1–CH2、EF12–EF34和頸部結構域中觀察到了顯著的特征向量分量，表明這些區域具有相對較高的柔韌性。總之，我們的SimHS-AFMfit-MD方法展示了捕獲和分類Ca²⁺結合和非結合alpha-輔肌動蛋白原子構象動力學的能力。

通過整合HS-AFM與AFMfit-NMA、AFMfit-MD以及通過SimHS-AFMfit-MD進行的MD模擬，我們生成了全面的原子構象庫，并針對MD軌跡進行了驗證。這種方法使得能夠通過PCA研究alpha-輔肌動蛋白的物理運動和原子結構，同時也提供了一種強大的方法來增強低分辨率AFM數據的解釋。例如，alpha-輔肌動蛋白的扭轉和彎曲運動通過由MD軌跡引導的AFMfit和無偏全原子MD模擬進行了交叉驗證。這種能力可能有助于更好地理解先前使用X射線衍射和冷凍電鏡進行的靜態結構研究。來自SimHS-AFMfit-MD的數據有助于開發用于模擬復雜蛋白質模型的力場。更廣泛地說，構象庫還可以作為深度學習模型的訓練數據，幫助預測跨時間尺度的蛋白質動力學，并彌合實驗與計算方法之間的差距。