幾十年來，微藻被研究作為多種應(yīng)用的有前景的來源，包括食品和飼料、制藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖、廢水處理以及植物生物刺激劑[1]、[2]、[3]。在大多數(shù)應(yīng)用中，需要釋放細(xì)胞內(nèi)代謝物。許多目標(biāo)成分實際上位于細(xì)胞內(nèi)部，但由于微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜且通常較為堅硬，有效回收這些化合物仍具有挑戰(zhàn)性。這不僅適用于高價值化合物的提取，也適用于需要利用整個生物質(zhì)的應(yīng)用（例如提高食品中的營養(yǎng)素生物利用率[4]）。因此，有效的細(xì)胞破壞過程對于釋放微藻生物質(zhì)的全部潛力至關(guān)重要。

不同微藻種類的細(xì)胞壁硬度和組成差異很大[5]、[6]、[7]。某些種類（如）缺乏堅硬的細(xì)胞壁，易于裂解；而許多微藻則具有多層堅硬的細(xì)胞壁，形成難以穿透的結(jié)構(gòu)屏障。例如，具有工業(yè)前景的微藻如、和的細(xì)胞壁由纖維素、類孢粉質(zhì)聚合物和/或藻酸鹽等剛性生物聚合物構(gòu)成[7]、[8]、[9]、[10]。根據(jù)最終產(chǎn)品和提取方法的不同，可能需要完全或部分破壞細(xì)胞以有效釋放細(xì)胞內(nèi)代謝物。對于熱敏感代謝物，可能需要采用更溫和的方法以保持產(chǎn)品完整性。因此，細(xì)胞破壞不僅涉及破壞細(xì)胞壁，還需根據(jù)具體應(yīng)用和后續(xù)加工策略優(yōu)化相關(guān)過程[5]、[8]。

近年來，多種微藻細(xì)胞破壞技術(shù)得到了研究，其中珠磨法、高壓均質(zhì)化和超聲波處理對于具有堅硬細(xì)胞壁的微藻（如C. vulgaris）最具潛力[8]、[11]。盡管已有大量相關(guān)研究，但由于缺乏不同處理方法的破壞動力學(xué)比較研究，選擇合適的技術(shù)仍具有挑戰(zhàn)性。然而，這些信息對于評估破壞效率以及產(chǎn)品質(zhì)量和能源效率至關(guān)重要。此外，也有研究針對重新懸浮的凍干微藻進行了破壞實驗[12]、[13]、[14]。雖然有研究表明凍干預(yù)處理可能影響破壞效率[15]，但尚未通過破壞動力學(xué)進行機制分析。

在本研究中，將比較兩種技術(shù)：珠磨法和超聲波處理。珠磨法利用小珠子（通常由玻璃、陶瓷或氧化鋯制成）高速攪拌微藻懸浮液，珠子與細(xì)胞碰撞產(chǎn)生的沖擊力和剪切力會破壞細(xì)胞壁[8]、[11]。雖然珠磨法已被證明對微藻破壞有效，但需優(yōu)化操作參數(shù)（如珠子大小、攪拌速度和停留時間[16]、[17]、[18]、[19]）。該過程能耗較高，冷卻對于防止微藻懸浮液過熱、保護熱敏感化合物至關(guān)重要[11]。超聲波處理利用高頻聲波（通常20–40 kHz）在液體介質(zhì)中產(chǎn)生空化現(xiàn)象。當(dāng)超聲波能量作用于微藻懸浮液時，會形成并劇烈破裂的氣泡，產(chǎn)生局部剪切力和沖擊波，從而破壞細(xì)胞壁[5]、[8]。實驗室規(guī)模的研究表明超聲波處理在批次模式下對微藻破壞效果良好[20]、[21]，但關(guān)于大規(guī)模半連續(xù)超聲波處理的效果知之甚少。據(jù)報道，大規(guī)模應(yīng)用時可能因能量效率低下和穿透力不足而降低破壞效率。此外，長時間處理可能導(dǎo)致敏感分子降解，但由于現(xiàn)有研究缺乏機制分析，這一問題常被忽視[5]、[8]。本研究將在半連續(xù)模式下大規(guī)模應(yīng)用這兩種技術(shù)，以填補相關(guān)研究空白。

為了有效評估和比較破壞方法，需理解細(xì)胞破壞是一個多階段的連續(xù)過程。正如Spiden等人所描述的[22]、[23]，微藻細(xì)胞破壞包括：(i) 細(xì)胞壁的初始物理損傷，(ii) 膜通透性和細(xì)胞質(zhì)泄漏，(iii) 大規(guī)模細(xì)胞裂解，最終導(dǎo)致(iv) 細(xì)胞完全破碎。這些階段可能按順序或同時發(fā)生，取決于所用的破壞方法和能量輸入。需要注意的是，各種分析方法都有其局限性，只能識別破壞過程的特定階段。因此，準(zhǔn)確評估細(xì)胞破壞通常需要結(jié)合多種分析技術(shù)[14]、[23]。顯微鏡分析可用于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，細(xì)胞計數(shù)可用于定量評估破壞程度[23]。代謝物釋放測量（如蛋白質(zhì)釋放或總代謝物吸收的紫外吸收測定）有助于量化目標(biāo)化合物，但這些間接方法往往高估或低估了微藻的破壞程度[23]。細(xì)胞內(nèi)釋放化合物的數(shù)據(jù)可提供關(guān)于破壞過程對產(chǎn)品質(zhì)量影響的額外信息，例如熱敏感化合物的溫度影響[20]、[23]。此外，顆粒大小分布測量可用于量化群體層面的破壞情況，但當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞碎片聚集時，該方法會受到限制[14]、[23]。

選擇C. vulgaris作為研究對象，是因為其具有較高的工業(yè)價值，并且已知具有堅硬的多層細(xì)胞壁[7]、[24]。屬于綠藻門的屬微藻具有最復(fù)雜的細(xì)胞壁組成，其細(xì)胞壁可能包含(i)富含葡糖胺的成分，(ii)以甘露糖和葡萄糖為主要成分的細(xì)胞壁，或(iii)富含半乳糖、葡萄糖和甘露糖的細(xì)胞壁[6]、[7]、[25]。第一種類型的細(xì)胞壁硬度歸因于幾丁質(zhì)類多糖；多數(shù)研究者認(rèn)為C. vulgaris的細(xì)胞壁硬度主要由纖維素微纖維貢獻[6]、[20]、[26]、[27]。細(xì)胞壁硬度還受生長階段影響[28]，盡管有研究表明細(xì)胞壁厚度受培養(yǎng)條件影響，但并不一定影響其機械破壞敏感性[29]。

本研究的目的是比較珠磨法和超聲波處理對C. vulgaris細(xì)胞的破壞效果。兩種破壞方法均在大規(guī)模半連續(xù)模式下進行，以更貼近實際工業(yè)應(yīng)用。為了解破壞動力學(xué)，分析了不同處理時間的樣本，并建立了動力學(xué)模型。使用多種分析方法（包括顯微鏡觀察和細(xì)胞計數(shù)）量化細(xì)胞破壞程度以及可溶性蛋白質(zhì)、碳水化合物和色素的釋放情況。同時，通過比較新鮮收獲的微藻與凍干（并重新懸浮）微藻的破壞效果，研究了干燥步驟對破壞動力學(xué)的影響。因此，本研究為珠磨法和超聲波處理這兩種可擴展的微藻細(xì)胞破壞技術(shù)提供了重要見解。

對新鮮收獲的藻泥或凍干粉末制備的C. vulgaris懸浮液進行了不同時間的珠磨法和超聲波處理。處理過程中使用光學(xué)顯微鏡觀察微藻細(xì)胞，圖1展示了新鮮C. vulgaris懸浮液的顯微圖像。凍干C. vulgaris懸浮液也表現(xiàn)出類似的趨勢（圖像未展示）。在任何細(xì)胞破壞處理之前：