《Analytica Chimica Acta》：Extracellular vesicles released in vitro from a Parkinson's Disease-like model: a combined biochemical and spectroscopic approach as proof of concept for the diagnosis of neurodegenerative diseases
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選擇性檢測帕金森病相關外泌體的雙方法學研究，結合生物化學檢測和傅里葉變換紅外光譜分析，證實外泌體攜帶的α-突觸核蛋白聚合體可通過點印跡法識別及光譜特征區分，為液體活檢提供新思路。
薩布麗娜·羅曼諾（Sabrina Romanò）| 大衛·貝塞里爾·羅德里格斯（David Becerril Rodriguez）| 阿曼達·斯帕希烏（Amanda Spahiu）| 法比奧·多梅尼奇（Fabio Domenici）| 克勞迪婭·馬祖卡（Claudia Mazzuca）| 安東尼奧·克里森蒂（Antonio Cricenti）| 埃娃·克里斯蒂娜·克拉斯諾夫斯卡（Ewa Krystyna Krasnowska）| 安娜盧西亞·塞拉菲諾（Annalucia Serafino）
意大利國家研究委員會（CNR）轉化藥理學研究所，羅馬00133
摘要
背景
細胞外囊泡（EVs）是穩定的分子信號載體，能夠穿越血腦屏障，因此有望成為中樞神經系統疾病的無創生物標志物。
雖然它們的診斷潛力已經得到證實，并在許多腦腫瘤的臨床試驗中得到應用，但在帕金森病（PD）等神經退行性疾病中的應用仍處于探索階段。盡管研究人員已經證明EVs參與了α-突觸核蛋白的細胞間擴散（這是PD病理的一個特征），但由于缺乏標準化和選擇性的EV分離和分析方案，EVs作為疾病生物標志物的臨床應用仍然受到限制。
結果
在這里，我們提出了一種結合生化和光譜技術的雙重方法來選擇性檢測與PD相關的EVs。作為多巴胺能神經元的細胞模型，我們使用了經過視黃酸誘導分化的人類神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y，并對其施加6-羥基多巴胺（6-OHDA）以模擬類似PD的神經退行性變化。Western blot分析顯示，暴露于這種神經毒素的SH-SY5Y細胞中含有高分子量的α-突觸核蛋白，這些蛋白具有高度毒性，并且也在EVs中被檢測到。此外，一種對聚集的α-突觸核蛋白具有選擇性敏感性的點印跡（dot-blot）實驗表明，這些蛋白位于新鮮、完整的PD相關EVs的膜表面。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）還識別出可能與病理狀態相關的生化特征，從而區分出攜帶聚集α-突觸核蛋白的EVs。
意義
通過結合這些僅需少量樣本的生化和光譜方法，我們能夠選擇性地識別出攜帶聚集、有毒形式的α-突觸核蛋白的囊泡。我們的發現突顯了這些生物標志物在診斷和無創檢測方面的潛力，支持其在神經退行性疾病液體活檢中的潛在應用。
引言
帕金森病（PD）是一種逐漸發展的疾病，通常始于不易察覺的變化，如動作遲緩、輕微震顫和僵硬，這些癥狀常被誤認為是衰老的表現。然而，其背后是一個由于黑質致密部（substantia nigra compacta）中多巴胺能神經元逐漸喪失而引起的進行性神經退行過程，該區域對運動控制至關重要[2]、[3]。隨著疾病的發展，運動癥狀變得越來越嚴重，同時還會出現抑郁、認知衰退和自主功能障礙等非運動癥狀，進一步影響生活質量[4]。盡管經過數十年的研究，PD在早期階段的診斷仍然是一個重大的臨床挑戰[5]。目前沒有可靠的生前檢測方法，早期癥狀往往不具有特異性。目前的診斷主要基于臨床評估，許多病例的最終確認仍需通過尸檢[6]、[7]、[8]。等到運動癥狀出現時，神經元已經遭受了實質性和不可逆的損傷[9]、[10]，因此早期診斷至關重要但難以實現。這凸顯了迫切需要能夠早期識別疾病的敏感和特異性生物標志物，以便盡早干預并開發更有效的疾病修飾療法[5]、[11]。
神經退行性疾病（如PD）的一個特征是蛋白質（如α-突觸核蛋白）的錯誤折疊和聚集[12]，這會導致細胞內包涵體的形成，干擾神經元功能，尤其是在突觸前末端以及其他亞細胞區室[13]。PD及相關突觸核蛋白病以大腦組織中富含α-突觸核蛋白的包涵體（稱為路易小體）的積累為特征，這些包涵體促進了神經退行性變[14]、[15]。因此，在血液、尿液和腦脊液（CSF）等生物流體中檢測這種病理蛋白可以提高診斷能力[16]、[17]。近年來，外周生物標志物受到了關注，腦脊液分析通過測量α-突觸核蛋白及相關蛋白提供了有價值的信息，但腰椎穿刺的侵入性以及生物標志物水平的變異性限制了其常規臨床應用[18]。雖然已經確定了血液中的生物標志物候選物（如α-突觸核蛋白、DJ-1和LRRK2[19]），但由于它們的特異性較低——尤其是α-突觸核蛋白和DJ-1在健康個體中也存在——這限制了它們的診斷價值[5]。此外，這些標志物在體液中的濃度極低，估計不到總血蛋白的十億分之一和總腦脊液蛋白的百萬分之一[20]，使得技術上難以檢測。在這種情況下，開發敏感有效的生物標志物的有效策略是關注除可溶性蛋白之外的體液成分，例如細胞外囊泡（EVs）[21]。
EVs是一類異質性的細胞來源膜囊泡，分泌到細胞外空間。它們根據大小和生物發生方式可分為小囊泡（sEVs，包括外泌體（exosomes）和微囊泡（microvesicles）以及大囊泡（如凋亡小體（apoptotic bodies）[23]。
小囊泡（sEVs）以其直徑（約30–200納米）和特定的生物發生標志物（如Alix、TSG101、HSC70、HSP90β和四跨膜蛋白CD81、CD9、CD63）來定義[24]。在中樞神經系統（CNS）中，EVs參與細胞間通訊，并參與生理和病理過程[25]。特別是神經元和膠質細胞的EVs可以通過跨細胞轉運（transcytosis）穿越血腦屏障（BBB），從而進入全身循環并進入外周流體。
越來越多的證據表明，病理性的α-突觸核蛋白是通過sEVs的脂質雙層進行轉運的[27]、[28]。在血液[29]、[30]、血清[31]和唾液[32]等多種生物流體中持續檢測到來自EVs的α-突觸核蛋白。此外，人們普遍認為EV介導的轉運在促進PD病理在整個CNS中的傳播中起著重要作用[33]。
這些結果使得EVs成為無創檢測腦源性病理蛋白的有希望的生物標志物[34]，有可能克服PD生物標志物識別的一些主要挑戰[35]。
盡管EVs具有潛力，但基于EV的診斷方法的臨床應用仍受到缺乏標準化分離方案以及需要快速、選擇性和臨床適用的分析工具的限制。在這方面，無標記技術，特別是中紅外范圍內的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR），顯示出快速和非破壞性化學分析外泌體的潛力[36]。當與機器學習結合使用時，FT-IR可以區分與疾病相關的光譜模式，這一點在臨床[37]和體外研究[38]、[39]中得到了驗證。然而，其有限的分子特異性需要通過補充的生化驗證來彌補。為了克服這一限制而不采用可能引起樣本污染和EV丟失的囊泡裂解方案，我們提出了一種專門設計用于增強EV群體分析的雙重分析策略。
通過結合FT-IR光譜和靶向生化檢測，我們的方法可以同時實現全面的分子分析和與PD病理相關的囊泡亞型的選擇性識別。
實驗部分
體外模型和誘導類似PD的神經退行性變化的治療
人類神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y來自美國類型培養物收藏中心（ATCC）。SH-SY5Y細胞在Eagle’s Minimum Essential Medium（α-MEM，Gibco，Thermo Fisher Scientific Inc，美國）中以1:1的比例與HAM’s F12（Euroclone，Pero MI）混合培養，并添加了10%的熱滅活胎牛血清（dFBS，產品編號FBS-ED-12B，Capricorn Scientific，Ebsdorfergrund）、2 mM的L-谷氨酰胺、100 IU/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素
類PD的細胞模型
為了獲得盡可能接近人類情況的體外模型，我們將SH-SY5Y細胞分化為之前由我們團隊描述和表征的成熟多巴胺能神經元表型（SHSY5Ydiff[41]、[42]、[48]、[49]。如M&M部分所述，為了模擬PD的神經退行性特征，SHSY5Ydiff細胞被暴露于6-OHDA的神經毒性損傷，并在18小時后進行分析。
圖1顯示了形態（圖1a、b）和α-突觸核蛋白的比較分析
結論
在本研究中，我們證明了FT-IR光譜與我們在協議中開發和優化的選擇性點印跡檢測方法的結合，能夠特異性地檢測小細胞外囊泡中的疾病相關生物標志物。這種雙重方法所需的樣本量極少，可以從生化和結構兩個角度進行全面分子表征。我們的數據揭示了sEVs中存在有毒構象形式的α-突觸核蛋白
CRediT作者貢獻聲明
法比奧·多梅尼奇（Fabio Domenici）：資源提供、可視化、撰寫——審閱與編輯。克勞迪婭·馬祖卡（Claudia Mazzuca）：資源提供、軟件使用、可視化、撰寫——審閱與編輯。安東尼奧·克里森蒂（Antonio Cricenti）：方法學設計、資源提供、可視化、撰寫——審閱與編輯。埃娃·克里斯蒂娜·克拉斯諾夫斯卡（Ewa Krystyna Krasnowska）：概念構思、數據管理、正式分析、研究實施、方法學設計、項目監督、驗證、可視化、初稿撰寫——審閱與編輯。安娜盧西亞·塞拉菲諾（Annalucia Serafino）：資金獲取
利益沖突聲明
? 作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
致謝
本工作得到了歐盟下一代EU計劃“羅馬科技園—創新生態系統”、Fondazione Intesa Sanpaolo “慈善基金”項目B/2023/0162以及國家研究委員會項目DSB的支持。
